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黄藤素、没食子酸增加β-内酰胺类抗生素对产ESBLs大肠埃希菌的敏感性及其作用机理初步探讨

作　者: 罗芬芳
导　师: 张魁华
学　校: 江西农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 产ESBLs大肠埃希菌 β-内酰胺类抗生素 黄藤素 没食子酸
分类号: S859.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要


β-内酰胺类抗生素是人医和兽医的常用药物。因这类药物具有杀菌活性强、毒性低、适应症广及临床疗效较好等优点,所以在人医和兽医临床中发挥着非常重要的作用。但由于不合理的应用,产ESBLs菌问题日益严重,尤其是产ESBLs大肠埃希菌的出现,给临床抗感染治疗带来非常大的困难。目前为止,除了p-内酰胺酶抑制剂外,如克拉维酸、舒巴坦等,还没有发现一项成功的策略可以恢复β-内酰胺类抗生素对耐药菌的抗菌活性。中西药联合应用可以发挥各自的优势,能够获得优于单独使用西药或中药的疗效。由于单体是中药的有效成分,结构比较单一,有利于今后更加深入的研究其机制。因此本研究旨在联合β-内酰胺类抗生素,从14种中药单体中筛选p-内酰胺类抗生素的增敏剂,并对其增敏机制进行初步探讨。目的：筛选单体能增加β-内酰胺类抗生素对产ESBLs大肠埃希菌敏感性；探讨筛选出的单体与p-内酰胺类抗生素联合应用的增敏机制,并希望能为临床中西医结合治疗产ESBLs耐药菌提供一定的用药依据。方法：1、采用二倍微孔稀释法测定5种β-内酰胺类抗生素对6株产ESBLs大肠埃希菌及6株相应的接合子的MIC；筛选对p-内酰胺类抗生素有增敏作用的单体；2、采用二倍微孔稀释法检测筛选出的单体对产ESBLs大肠埃希菌MIC值；采用棋盘法检测单体联合不同p-内酰胺类抗生素对产ESBLs大肠埃希菌的FIC值；3、采用动态生长曲线法观察不同p-内酰胺类抗生素单独或联合黄藤素、没食子酸使用时对产ESBLs大肠埃希菌的抑制作用；4、采用实时荧光定量PCR检测合适浓度单体(黄藤素、没食子酸)、头孢噻肟或联合使用时对产ESBLs大肠埃希菌酶基因mRNA表达水平的影响。结论：1、12株产ESBLs大肠埃希菌对p-内酰胺类抗生素均高度耐药；2、成功筛选出单体黄藤素、没食子酸能提高p-内酰胺类抗生素对产ESBLs大肠埃希菌的敏感性。但单独的黄藤素、没食子酸对产ESBLs大肠埃希菌几乎没有抗菌作用；3、黄藤素广泛地增加了产ESBLs大肠埃希菌对不同β-内酰胺类抗生素的敏感性,没食子酸也增加了产ESBLs大肠埃希菌对不同β-内酰胺类抗生素的敏感性,但作用效果不及黄藤素广泛；4、单独的黄藤素或联合头孢噻肟对于产ESBLs大肠埃希菌中的广谱酶blaCTX-M-1G、blaCTX-M-9G的mRNA表达水平并没有明显影响,表明黄藤素的抗菌增敏感作用可能并不是通过影响β-内酰胺酶mRNA表达水平；单独的没食子酸或联合头孢噻肟对于产ESBLs大肠埃希菌4J的blaCTx-M-1G mRNA表达水平没有明显影响,但是对原菌4的blaCTX-M-1G表达水平有明显影响,均能降低其blaCTX-M-1G mRNA表达水平。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
英文缩写词表  11-12
前言  12-13
第一部分 文献综述  13-23
  第一章 细菌耐药性的研究进展  13-19
    1 耐药性细菌产生的主要原因  13-14
      1.1 天然耐药性  13
      1.2 获得耐药性  13-14
    2 细菌耐药性产生的机制  14-16
      2.1 细菌耐药产生的生化机理  14-15
        2.1.1 细菌产生破坏抗生素结构的酶  14
        2.1.2 靶位的改变  14
        2.1.3 主动外排系统  14-15
        2.1.4 细菌细胞膜通透性的改变  15
        2.1.5 细菌生物被膜的形成  15
      2.2 细菌耐药产生的遗传机理  15-16
        2.2.1 自身性基因突变  16
        2.2.2 获得外源基因  16
    3 细菌耐药性的防治措施  16-19
      3.1 寻找耐药性抑制剂  16-18
        3.1.1 灭活酶抑制剂开发  16
        3.1.2 噬菌体制剂的研究  16
        3.1.3 外排泵抑制剂的开发  16-17
        3.1.4 细菌生物被膜抑制剂  17
        3.1.5 细菌外膜通透性抑制剂  17
        3.1.6 耐药质粒消除剂  17
        3.1.7 细菌群体感应抑制剂  17-18
        3.1.8 中药耐药抑制剂开发  18
      3.2 研制抗细菌耐药的非抗生素药物  18-19
        3.2.1 抗菌肽  18
        3.2.2 调节肠道正常菌群制剂  18
        3.2.3 新型的基因工程药物  18
        3.2.4 特异性疫苗的研制  18-19
        3.2.5 蛋白类特别是酶类抗菌药物  19
  第二章 中药逆转细菌耐药机制的研究进展  19-23
    1 中药的抗菌作用及机制  19-20
      1.1 中药的选择  19
      1.2 中药的抑菌成分  19
      1.3 中药成分抗菌机制  19
      1.4 中药抗菌作用  19-20
    2 中药逆转细菌耐药机制及实验研究  20-21
      2.1 中药抑制β-内酰胺酶  20
      2.2 中药消除R质粒  20-21
      2.3 中药抑制细菌主动外排泵  21
      2.4 中药抑制细菌生物膜的形成  21
      2.5 中药对耐药基因的突变作用  21
    3 中药逆转存在的问题  21-22
    4 展望  22-23
第二部分 试验部分  23-55
  试验一 产ESBLs大肠埃希菌中药单体抗菌增效剂的筛选  23-33
    1 材料与方法  23-28
      1.1 材料  23-24
        1.1.1 样品来源  23
        1.1.2 标准菌株  23
        1.1.3 药物  23-24
        1.1.4 培养基及其他试剂  24
        1.1.5 PCR引物  24
        1.1.6 主要仪器设备  24
      1.2 方法  24-28
        1.2.1 抗生素药物母液配制  24-25
        1.2.2 中药单体化合物的溶解和稀释  25
        1.2.3 细菌的复苏  25
        1.2.4 验证产ESBLs菌株  25-26
        1.2.5 二倍微孔稀释法测最小抑菌浓度(MICs)  26-27
        1.2.6 筛选联合β-内酰胺类抗生素对产ESBLs大肠埃希菌有增敏作用的中药单体  27-28
    2 结果  28-30
      2.1 12株产ESBLs大肠埃希菌耐药基因电泳图  28-29
      2.2 5种β-内酰胺类抗生素对ESBLs的抗菌作用  29-30
      2.3 筛选对产ESBLs大肠埃希菌有增敏作用的单体  30
    3 讨论  30-32
      3.1 产ESBLs菌株及其耐药机制  30-31
      3.2 中药单体抗菌增敏剂的筛选  31-32
    4 结论  32-33
  试验二 黄藤素、没食子酸体外单独及联合抗菌作用  33-42
    1 材料与方法  33-34
      1.1 材料  33
        1.1.1 样本来源  33
        1.1.2 培养基、药物及其他试剂  33
        1.1.3 主要仪器设备  33
      1.2 实验方法  33-34
        1.2.1 黄藤素、没食子酸对大肠埃希菌的抗菌增敏作用  33-34
        1.2.2 单体与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌动态生长的影响  34
    2 结果  34-39
      2.1 黄藤素、没食子酸对大肠埃希菌的抗菌作用  34
      2.2 棋盘法联合药敏试验结果  34-36
        2.2.1 黄藤素增敏β-内酰胺类抗生素的抗菌作用  34-35
        2.2.2 没食子酸增敏β-内酰胺类抗生素的抗菌作用  35-36
      2.3 黄藤素、没食子酸与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌生长的影响  36-39
        2.3.1 256μg/mL黄藤素与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌1J动态生长的影响  36-37
        2.3.2 256μg/mL黄藤素与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌3J动态生长的影响  37-38
        2.3.3 256μg/mL没食子酸与1/2MIC浓度的抗菌药物联合应用对细菌4J动态生长的影响  38-39
    3 讨论  39-41
      3.1 中药对耐药菌的抑菌作用  39-40
        3.1.1 中药的抑菌作用  39-40
      3.2 中药与西药协同抗菌作用  40
      3.3 黄藤素、没食子酸与β-内酰胺类抗生素联合抑菌试验  40-41
    4 结论  41-42
  试验三 黄藤素、没食子酸对ESBLs中超广谱β-内酰胺酶的影响  42-55
    1 材料与方法  42-45
      1.1 实验材料  42-43
        1.1.1 菌株来源及其试剂  42
        1.1.2 主要仪器  42
        1.1.3 常用溶液配制  42
        1.1.4 引物合成  42-43
      1.2 方法  43-45
        1.2.1 256μg/mL黄藤素联合128μg/mL头孢噻肟对大肠埃希1J bla_(CTX-M-1G)的mRNA表达水平的影响  43-45
        1.2.2 统计学分析  45
    2 实验结果  45-52
      2.1 荧光定量PCR引物的鉴定及引物退火温度  45
      2.2 bla_(CTX-M-1G)、bla_(CTX-M-9G)、gapA基因定量PCR的特异性  45-52
        2.2.1 扩增动力学曲线图  45-46
        2.2.2 溶解曲线特异性分析  46-47
        2.2.3 基因bla_(CTX-M-1G)、bla_(CTX-M-9G)表达水平的分析  47-52
    3 讨论  52-54
      3.1 荧光定量PCR方法概述及中药抗菌增效机制的初步探讨  52-53
      3.2 中西联合在畜牧业中的优势  53-54
    4 结论  54-55
参考文献  55-60
致谢  60

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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学（兽医学） > 兽医药物学 > 兽医药理学
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