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表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠皮肤烫伤创面愈合的影响

作　者: 张江江
导　师: 李卫国
学　校: 河南师范大学
专　业: 生理学
关键词: 表没食子儿茶素-3-没食子酸酯肿瘤坏死因子-α 白介素-1β 基质金属蛋白酶-1 基质金属蛋白酶抑制因子烫伤皮肤小鼠
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

烫伤是皮肤创伤的一种常见形式,皮肤创伤修复是一个涉及炎症反应、新组织形成和组织重建的复杂病理生理过程。在这一过程中,有多种组织、修复细胞和细胞外基质及各种细胞调控因子参与其中,其中肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、白细胞介素-1β(interleukin-1β, IL-1β)是参与炎症反应的主要细胞因子,对炎症反应的发生、发展以及新组织的形成与组织结构的重建都起到了重要的调节作用。表没食子儿茶素-3-没食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate, EGCG)是绿茶多酚的主要成分,具有抗氧化、抗肿瘤、抗炎症反应等特性。有研究表明EGCG能抑制肿瘤细胞TNF-α、IL-1β和MMP-1基因的表达和生成,并促进基质金属蛋白酶抑制因子-1 (tissue inhibitor of metalloproteinase-1, TIMP-1)基因的表达,以及由TNF-α、IL-1β、MMP-1和TIMP-1基因诱导的炎症反应。本实验室前期的研究表明EGCG抑制皮肤伤口愈合期间IL-1β的基因表达,降低组织IL-1β的水平,推测EGCG可能具有抑制伤口炎症过度发生、促进皮肤伤口愈合的作用。为探讨EGCG对烫伤皮肤修复的生物学作用及其机制,本研究建立并使用了小鼠烫伤模型,采用形态学、组织学、逆转录聚合酶链反应(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR)和酶联免疫吸附法(enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA)方法观察了正常皮肤烫伤的细胞因子的变化并分析了EGCG涂敷引起的烫伤皮肤伤口的变化,并探讨了EGCG对烫伤皮肤修复期间组织TNF-α、IL-1β、MMP-1和TIMP-1基因表达水平及生成的影响,以期为临床运用EGCG改善烫伤皮肤修复提供实验依据。通过形态学和组织学观察可以看出:0.2 mg/g EGCG涂敷处理的小鼠烫伤皮肤伤口首先愈合,说明0.2 mg/g EGCG能促进小鼠烫伤皮肤伤口的愈合。半定量RT-PCR实验结果显示,皮肤烫伤部位涂敷0.2 mg/g EGCG后组织的TNF-α、IL-1β和MMP-1基因表达水平下降,TIMP-1基因表达水平上调;能够抑制损伤部位的TNF-α、IL-1β和MMP-1基因表达,促进TIMP-1基因的表达;和ELISA促进TIMP-1基因的表达;并降低损伤部位TNF-α、IL-1β和MMP-1的含量,说明0.2 mg/g EGCG能够使小鼠烫伤部位TNF-α、IL-1β和MMP-1水平快速恢复到正常水平,也同样说明0.2 mg/g EGCG能够促进小鼠烫伤皮肤伤口的愈合。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-7
缩略词表  7-12
文献综述  12-24
  1 烫伤修复  12-20
    1.1 烫伤修复的基本过程  12-14
    1.2 炎症反应在烫伤愈合中的作用  14-15
    1.3 细胞活性因子在烫伤愈合中的作用  15-17
    1.4 修复细胞在烫伤愈合中的作用  17-18
    1.5 基质金属蛋白酶类在烫伤愈合中的作用  18-20
  2 表没食子儿茶素没食子酸酯  20-24
    2.1 表没食子儿茶素没食子酸酯简介  20
    2.2 EGCG 的作用  20-24
1 前言  24-26
2 材料和方法  26-44
  2.1 实验材料  26-30
    2.1.1 实验动物  26
    2.1.2 主要试剂  26-27
    2.1.3 主要仪器设备  27
    2.1.4 试剂的配制  27-30
  2.2 不同时间不同处理组烫伤小鼠伤口直径的测量  30-31
    2.2.1 实验动物烫伤模型的建立  30
    2.2.2 实验动物的分组  30-31
    2.2.3 小鼠伤口长度的测量  31
  2.3 不同时间不同处理组小鼠皮肤伤口组织学切片  31-32
    2.3.1 盖玻片和载玻片的处理  31
    2.3.2 实验步骤  31-32
    2.3.3 皮肤石蜡切片结果观察保存  32
  2.4 总RNA 提取  32-35
    2.4.1 实验用品的RNase-free 处理  32-33
    2.4.2 RNA 提取操作步骤  33-34
    2.4.3 RNA 浓度和纯度检测  34
    2.4.4 RNA 完整性检测  34-35
    2.4.5 RNA 琼脂糖凝胶电泳上样量的分析  35
    2.4.6 RNA 的保存  35
  2.5 逆转录反应  35-36
    2.5.1 试剂的分装  35
    2.5.2 操作步骤  35-36
  2.6 小鼠烫伤皮肤MMP-1 基因的PCR 扩增  36-37
    2.6.1 试剂的分装  36
    2.6.2 MMP-1 引物  36-37
    2.6.3 操作步骤  37
    2.6.4 PCR 产物的电泳检测  37
  2.7 小鼠烫伤皮肤TIMP-1 基因的PCR 扩增  37-38
    2.7.1 TIMP -1 引物  38
    2.7.2 操作步骤  38
    2.7.3 PCR 产物的电泳检测  38
  2.8 小鼠烫伤皮肤IL-1β基因的PCR 扩增  38-39
    2.8.1 IL-1β引物  38-39
    2.8.2 操作步骤  39
    2.8.3 PCR 产物的电泳检测  39
  2.9 小鼠烫伤皮肤TNF-α基因的PCR 扩增  39-40
    2.9.1 TNF-α引物  39
    2.9.2 操作步骤  39-40
    2.9.3 PCR 产物的电泳检测  40
  2.10 小鼠β-Actin 基因的PCR 扩增  40
    2.10.1 小鼠β-actin 基因引物设计  40
    2.10.2 实验步骤  40
    2.10.3 PCR 产物的电泳检测  40
  2.11 ELISA 水平  40-42
    2.11.1 实验设计  40
    2.11.2 小鼠组织匀浆的制备  40-41
    2.11.3 小鼠MMP-1 浓度的测定  41-42
  2.12 小鼠IL-1β以及TNF-α的ELISA 检测  42-44
3 结果  44-66
  3.1 EGCG 对皮肤切口愈合时间的影响  44-45
  3.2 EGCG 对皮肤切口愈合效应的组织学观察  45
  3.3 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤MMP-1 分泌的影响  45-48
  3.4 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤MMP-1 基因表达的影响  48-51
    3.4.1 半定量比较小鼠烫伤皮肤MMP-1 基因表达差异  48-51
  3.5 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TIMP-1 基因表达的影响  51-55
    3.5.1 TIMP-1 基因的RT-PCR 扩增结果  51-52
    3.5.2 半定量比较小鼠损伤皮肤TIMP-1 基因表达差异  52-55
  3.6 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤IL-1β分泌的影响  55-57
  3.7 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤IL-1β基因表达的影响  57-60
    3.7.1 IL-1β基因的RT-PCR 扩增结果  57
    3.7.2 半定量比较小鼠损伤皮肤IL-1β基因表达差异  57-60
  3.8 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TNF-α分泌的影响  60-62
  3.9 EGCG 对小鼠损伤部位皮肤TNF-α基因表达的影响  62-66
    3.9.1 TNF-α基因的RT-PCR 扩增结果  62
    3.9.2 半定量比较小鼠损伤皮肤TNF-α基因表达差异  62-66
4 讨论  66-70
  4.1 EGCG 对皮肤烫伤愈合时间和组织学的影响  66
  4.2 EGCG 对MMP-1、IMP-1 分泌和基因表达的影响  66-68
  4.3 EGCG 对 IL-1β和 TNF-α 分泌和基因表达的影响  68-70
5 结论  70-72
参考文献  72-78
致谢  78-80
攻读学位期间发表的学术论文目录  80-81

表没食子儿茶素没食子酸酯对小鼠皮肤烫伤创面愈合的影响

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