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CD25结合位点修饰性hIL-2在毕赤酵母中的表达及活性鉴定
作 者: 王松
导 师: 苗利光
学 校: 中国农业科学院
专 业: 兽医
关键词: 重组hIL-2 毕赤酵母 诱导表达 纯化
分类号: S859.79
类 型: 硕士论文
年 份: 2012年
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内容摘要
白细胞介素2(IL-2)是一种15kDa大小的单体球状糖蛋白,其分子空间结构具有4个α螺旋并进一步折叠成典型的Ⅰ型细胞因子结构。IL-2在体内主要由活化的T细胞分泌,能够促进T细胞、B细胞及NK等细胞大量增殖,促进B细胞分化和分泌抗体。hIL-2是一种天然的免疫增强剂,具有很强的抗感染、抗肿瘤等多种作用。IL-2在体外能够诱导淋巴因子激活杀伤细胞(LAK)增殖,据此,人们将IL-2和LAK细胞联合应用治疗晚期肿瘤病人,并取得了一定疗效。然而,IL-2治疗肿瘤的效果被严重的毒副作用限制着。近年来大量的研究结果揭示,IL-2在体内的主要作用为维持调节性T细胞(Treg)的生存和增殖,由此进一步发挥免疫抑制作用。多年以来,科学家致力于研究新型修饰性hIL-2,期望提升其抗肿瘤活性的同时降低其毒副作用。本试验根据人白细胞介素2(hIL-2)的氨基酸序列和三维结构,在不改变其空间构象的基础上修饰其基因序列,使修饰后的hIL-2(mhIL-2)蛋白失去了与CD25亚基结合的能力。采用人工合成的方法合成了目的基因片段并将其插入真核表达载体pPIC9K中,构建了mhIL-2的表达载体pPIC9k-mhIL-2,利用毕赤酵母对mhIL-2进行了表达。MhIL-2经诱导表达后,对表达上清液进行了SDS-PAGE、Western blot检测。测定结果显示我们高效表达出了mhIL-2,相对分子量为15kDa。分别利用脱盐层析、离子交换层析和凝胶过滤层析对mhIL-2进行纯化,纯化后的mhIL-2经SDS-PAGE鉴定为一单一条带,说明mhIL-2被成功纯化出来,纯品mhIL-2浓度为0.45g/L。在mhIL-2活性实验中,mhIL-2能够很好的刺激IL-2依赖性CTLL-2细胞增殖。体内活性实验中发现mhIL-2可以高效的增强小鼠机体的免疫能力。本实验为进一步研究高效的,低副作用的hIL-2产品奠定了基础。
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全文目录
摘要 6-7 Abstract 7-10 英文缩略表 10-11 第一章 绪论 11-23 1.1 白细胞介素 2 11-12 1.1.1 IL-2 基因结构及蛋白特征 12 1.1.2 IL-2 的生物活性 12 1.2 IL-2 受体(IL-2R) 12-16 1.2.1 IL-2R 的分子特征 12-14 1.2.2 IL-2R 信号转导及体外 IL-2R 的表达 14-16 1.3 体内 IL-2 和 IL-2R 的表达 16-17 1.4 IL-2 分泌的调节 17-18 1.5 IL-2 对免疫系统的影响 18-20 1.5.1 IL-2 与 T 细胞凋亡 18-19 1.5.2 IL-2 对 Treg 细胞的作用 19 1.5.3 IL-2 与自身免疫疾病的联系 19-20 1.6 IL-2/IL-2R 功能紊乱—起因及影响 20 1.7 IL-2 在免疫治疗中的应用 20-21 1.8 本试验研究目的与意义 21-23 第二章 PPIC9K-MHIL-2 表达载体的构建及转化毕赤酵母 GS115 23-36 2.1 材料和方法 23-31 2.1.1 主要仪器和试剂 23 2.1.2 溶液的配制及培养基 23-26 2.1.3 感受态细胞的制备 26-27 2.1.4 pPIC9K-mhIL-2 重组表达载体的构建 27-30 2.1.5 重组表达载体 pPIC9K-mhIL-2 转化毕赤酵母 GS115 30-31 2.1.6 阳性转化子的筛选 31 2.2 结果 31-34 2.2.1 pPIC9K-mhIL-2 重组表达载体的构建 31-34 2.2.2 重组表达载体 pPIC9K-mhIL-2 转化毕赤酵母 GS115 34 2.3 讨论 34-36 第三章 MHIL-2 的诱导表达与纯化 36-44 3.1 材料和方法 36-41 3.1.1 主要仪器和试剂 36 3.1.2 溶液的配置及培养基 36-39 3.1.3 MhIL-2 的诱导表达及 SDS-PAGE、Western blot 鉴定 39-40 3.1.4 MhIL-2 的纯化 40-41 3.1.5 MhIL-2 浓度测定 41 3.2 结果 41-43 3.2.1 表达产物的 SDS-PAGE 及 Western Blot 检测 41 3.2.2 MhIL-2 的纯化 41-42 3.2.3 mhIL-2 浓度测定 42-43 3.3 讨论 43-44 第四章 MHIL-2 活性测定 44-49 4.1 材料和方法 44-45 4.1.1 主要仪器和试剂 44 4.1.2 ~3H-TdR 法测定 mhIL-2 活性 44-45 4.1.3 MhIL-2 体内活性的测定 45 4.2 结果 45-48 4.2.1 ~3H-TdR 法测定 mhIL-2 活性 45-46 4.2.2 MhIL-2 体内活性实验 46-48 4.3 讨论 48-49 第五章 结论 49-50 参考文献 50-59 致谢 59-60 作者简历 60
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中图分类: > 农业科学 > 畜牧、动物医学、狩猎、蚕、蜂 > 动物医学(兽医学) > 兽医药物学 > 兽用药品
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