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甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立及通用型猪流感疫苗基础研究

作　者: 王斌
导　师: 童光志
学　校: 东北农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 流感甲流病毒伪型病毒通用型疫苗抗原捕获ELISA 单克隆抗体
分类号: S855.3
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

流感是人类面临的主要公共健康问题之一。流感病毒在进化过程中发生导致抗原性改变的突变(抗原漂移)或不同流感病毒之间发生基因重配而产生一种新的流感病毒(抗原转变)是其逃避宿主免疫系统、得以在感染群体之间传播的主要策略。2009年开始流行的猪源新型H1N1流感病毒(以下简称甲流病毒)导致了人类历史的第四次流感大流行,该病毒比普通季节流感病毒具备更强的传播能力,在流行过程中病毒又由人回传给了猪。虽然该病毒已不再呈大流行态势,但其与其他流感病毒发生基因重配可能会产生毒力更强的病毒,因此有必要建立准确、特异的病原学检测方法以及可以评价不同宿主群体感染状态的血清学诊断方法,以监测病毒的流行和传播规律,掌握其在不同宿主群体中的感染状况,继而帮助为下一次流感爆发做出预警。本研究从病原学和血清学两个方面分别建立了病毒及血清中和抗体的检测方法。首先利用构建的杆状病毒表面展示系统筛选到一株甲流病毒特异性的单抗,对单抗的表位进行鉴定后发现60KLRG63为表位的最小活性单元,同时该表位不能被全病毒感染的阳性血清识别,提示表位不是HA分子的优势表位,其所受的免疫压力要小于HA分子上的优势表位,故在病毒流行过程中不易发生变异,从而可保证单抗对病毒的有效识别；同时对抗原表位的保守性分析发现该表位是甲流病毒特有的,表明可以利用单抗特异地检测甲流病毒。结合兔抗HA蛋白多抗建立了抗原捕获ELISA方法,并对各个抗体的工作浓度进行了优化；敏感性试验表明所建立的方法比常规血凝试验至少敏感8倍；特异性试验表明用建立的方法检测不到人的季节性H1N1流感病毒及H1N1、H3N2猪流感病毒,对实验室感染样品的检测发现该方法与鸡胚病毒分离法具有较好的符合率,但不如病毒分离敏感。以上结果表明利用甲流病毒特异性的单抗建立的抗原捕获ELISA方法可以作为甲流病毒特异性的病原学检测的工具。将人工合成的甲流病毒A/Califorina/04/2009株HA基因连接至真核表达载体pcDNA3.1,该重组质粒与表达逆转录病毒相关元件的骨架质粒pHIT111及pHIT60共转染人胚胎肾细胞293T,构建了以鼠白血病病毒为核心、包装有HA蛋白的伪型病毒。通过对伪型病毒感染细胞中报告基因表达产物的检测,证明伪型病毒可成功感染MDCK及293T细胞；同时其感染过程可被重组甲流病毒免疫的小鼠的阳性血清所阻断,表明该伪型病毒可模拟野生型病毒完成对宿主细胞的感染过程,提示该伪型病毒系统可作为一个特异性检测甲流病毒中和抗体的应用平台,从而为准确的评价机体感染状态或抗病毒药物筛选、疫苗评价等提供辅助工具。同时,本研究在缺少野生型病毒的条件下,利用公共数据库所登载的目的序列构建了与天然病毒具有相似感染特性的伪型病毒。因此理论上,其他相似的病毒表面膜蛋白也可根据本研究报道的方法构建伪病毒系统,而不依赖于某种特定病原的分离、鉴定。该方法特别对于高度危险性病原研究具有一定的意义。猪在流感病毒生态中扮演着重要的角色。由于猪的呼吸道上皮细胞同时具有人流感病毒和禽流感病毒的受体,使其极有可能成为新流感病毒的产生源头。控制猪流感(Swine influenza, SI)的发生和发展有助于减少流感病毒对人类的健康威胁。疫苗免疫是预防SI的有效手段。当前商品化的SI疫苗为包括Hl和/或H3亚型病毒的灭活疫苗。与人流感疫苗不同,SI疫苗并不会按照当年流行的优势毒株更换疫苗种子毒,由于流行毒株的抗原性变异,经常导致现有商品化疫苗无法对其提供有效免疫保护的情况。鉴于此,本研究尝试利用保守的SIV抗原组分构建具有广谱交叉保护效力的DNA疫苗。第一组DNA疫苗将H3亚型SIV共有的M2e及HA蛋白序列的编码基因连接至表达载体(MHa);第二组在此基础上添加一个保守的T细胞表位(MNHa),以增强疫苗诱导T细胞免疫应答的能力。通过基因枪免疫小鼠后发现,两组DNA疫苗能有效刺激机体产生体液免疫应答,同时MNHa比MHa诱导了更高水平的T细胞免疫应答。攻毒保护实验表明两组疫苗都能够对同源H3亚型处在不同进化谱系的病毒攻击提供完全免疫保护,提示增强的T细胞免疫应答对于同亚型病毒的交叉保护来讲可能不是必需的；而与MHa相比,MNHa提供了更显著的对于异源H1亚型病毒攻击的保护效力,用H1亚型病毒攻击小鼠后,MNHa免疫组小鼠肺脏内病毒滴度及组织病理学损伤显著低于MHa免疫组,表明T细胞免疫应答在提供异源毒株的交叉保护方面起到重要作用。本研究在通用型SI疫苗研究方面进行了有益探索,并为未来SI疫苗的研制提供了可借鉴的思路。

全文目录

摘要  10-12
Abstract  12-14
1 引言  14-25
  1.1 流感与流感病毒  14-15
    1.1.1 流感  14
    1.1.2 流感病毒  14-15
  1.2 中国大陆猪流感病毒流行特征及未来值得关注的几个问题  15-19
    1.2.1 中国大陆SIV流行特征  15-17
    1.2.2 未来值得关注的几个问题  17-19
  1.3 猪流感疫苗研究进展  19-24
    1.3.1 灭活疫苗  19-20
    1.3.2 弱毒疫苗  20-21
    1.3.3 病毒活载体亚单位疫苗  21-22
    1.3.4 基因工程DNA疫苗  22-23
    1.3.5 已应用于人或其他动物流感但尚未在SIV上应用的疫苗研发系统  23-24
  1.4 本研究的目的和意义  24-25
2 材料与方法  25-43
  2.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立  25-37
    2.1.1 质粒、菌株、病毒及细胞  25
    2.1.2 主要试剂及仪器  25
    2.1.3 重组A/Brisbane/59/2007(H1N1)[BR07]毒株HA蛋白的PR8病毒的构建  25-27
    2.1.4 r07、r09的纯化及全病毒多抗的制备  27
    2.1.5 BR07HA与CA09HA基因在杆状病毒中的表达  27-29
    2.1.6 特异性识别大流行流感病毒的单克隆抗体的制备  29-31
    2.1.7 单抗的抗原表位鉴定  31-35
    2.1.8 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立  35-37
  2.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建  37-38
    2.2.1 载体、血清及主要试剂  37
    2.2.2 表达HA基因的真核表达载体的构建及鉴定  37
    2.2.3 伪型病毒的包装  37-38
    2.2.4 报告基因LacZ表达检测  38
    2.2.5 伪型病毒感染的中和试验  38
    2.2.6 统计学分析  38
  2.3 通用型猪流感疫苗基础研究  38-43
    2.3.1 质粒、毒株、细胞、血清  38-39
    2.3.2 主要试剂及仪器  39
    2.3.3 DNA疫苗的设计  39
    2.3.4 重组质粒的构建及验证  39-40
    2.3.5 重组质粒的体外表达  40
    2.3.6 基因枪子弹的制备  40-41
    2.3.7 小鼠的免疫及攻毒  41
    2.3.8 血清学试验  41
    2.3.9 IFN-γ ELISPOT  41-42
    2.3.10 攻毒后小鼠肺脏的病毒滴定  42
    2.3.11 组织病理学观察  42
    2.3.12 统计学分析  42-43
3 结果  43-62
  3.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立  43-54
    3.1.1 PBD-07HA重组质粒的PCR鉴定  43
    3.1.2 拯救病毒r07核酸序列验证  43
    3.1.3 拯救病毒r07的HA滴度测定  43
    3.1.4 重组杆粒的PCR鉴定  43-44
    3.1.5 重组杆状病毒的获得  44
    3.1.6 HA蛋白在细胞表面的表达  44-45
    3.1.7 特异性识别r09单抗的筛选  45-46
    3.1.8 血凝抑制试验及中和试验  46
    3.1.9 抗原表位的鉴定及5B12对r07、r09差异性识别的分子基础  46-50
    3.1.10 该表位不能被全病毒阳性血清识别  50-51
    3.1.11 抗原表位的保守性分析  51
    3.1.12 抗原捕获ELISA方法的建立  51-54
  3.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建  54-56
    3.2.1 HA基因表达载体的构建及在293T细胞中的表达  54-55
    3.2.2 HA蛋白整合的伪型病毒粒子具有感染性  55
    3.2.3 伪型病毒对细胞的感染可被阳性血清所中和  55-56
  3.3 通用型猪流感疫苗基础研究  56-62
    3.3.1 M2e、NP147-155及共有HA基因的扩增  56
    3.3.2 DNA疫苗的构建及鉴定  56-57
    3.3.3 DNA疫苗携带的外源基因在293T细胞中的表达  57-58
    3.3.4 两种DNA疫苗能有效刺激机体产生HA及M2e特异性抗体  58
    3.3.5 DNA疫苗诱导机体产生的HI抗体效价水平  58-59
    3.3.6 MNHa能够诱导NP147-155特异性的T细胞免疫应答  59
    3.3.7 MNHa比MHa显示出更强的异源保护效力  59-60
    3.3.8 MNHa能够比MHa更显著地抑制异源毒株攻击后小鼠肺脏发生的病变  60-62
4 讨论  62-66
  4.1 甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立  62-63
  4.2 整合大流行性H1N1流感病毒血凝素蛋白的伪型病毒的构建  63-64
  4.3 通用型猪流感疫苗基础研究  64-66
5 结论  66-67
致谢  67-68
参考文献  68-78
附录  78-79
攻读博士学位期间发表的学术论文  79

甲型H1N1流感病毒特异性抗原捕获ELISA方法的建立及通用型猪流感疫苗基础研究

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