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基于伪型病毒的猪瘟中和抗体检测方法的初步建立及猪瘟病毒E2蛋白的细胞定位研究

作　者: 贺番
导　师: 郝永清
学　校: 内蒙古农业大学
专　业: 预防兽医学
关键词: 伪型病毒复制缺陷型病毒转导转染病毒滴度中和抗体定位
分类号: S852.651
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
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内容摘要

猪瘟（Classical swine fever, CSF）是由猪瘟病毒（Classical swine fever virus, CSFV）引起猪群爆发的一种重要的烈性传染病,对养猪业危害极大。预防CSFV感染的有效方法是采用疫苗免疫,建立稳定而有效的中和抗体检测方法是评价疫苗免疫效果的重要手段。猪瘟伪型病毒（VSV△G*CSF）,是指用表达绿色荧光蛋白（GFP）的报告基因代替水疱性口炎病毒（Vesicular stomatitis virus,VSV）基因组中编码囊膜蛋白G的基因,从而形成含有报告基因的复制缺陷型病毒（VSV△G*）;当外源提供CSFV囊膜蛋白时,可与VSV△G*重新装配,整合成具有一过性感染力的VSV重组病毒VSV△G*CSF。该病毒拥有VSV的基因组,囊膜上整合有CSFV的囊膜蛋白,因此具有了CSFV的感染特征,这种基因型和表现型不一致的现象叫伪型,具有这种特征的病毒叫猪瘟伪型病毒。本研究通过构建表达CSFV全部囊膜蛋白的重组真核表达质粒pCAGG-E012顺式表达出CSFV囊膜蛋白Erns、E1和E2。结合已有对瘟病毒的报道,通过生物软件进行比对与分析后,推测位于CSFV囊膜蛋白E2基因跨膜区内的膜锚定序列是阻碍其表达在细胞表面的主要因素,对E2锚定序列进行部分缺失后发现:E2锚定序列的部分缺失会减少E2蛋白在细胞内的表达,说明锚定序列对E2的正确表达意义重大。只有表达全部CSFV囊膜蛋白,才能够研制出滴度相对较高的猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF,其病毒的滴度为10²～10³ pfu·mL^-1,且该病毒能够被抗CSFV的阳性血清所中和。传统检测猪瘟病毒中和抗体的ELISA以及间接免疫荧光方法普遍存在费时、繁琐、不够精确、特异性差等一系列缺陷,亟待改进。为了提高CSFV中和抗体检测的效率和生物安全性、研究CSFV的侵染机制,本研究制备出含有报告基因的复制缺陷型VSV/CSFV伪型病毒（VSV△G*CSF）作为代替野生型CSFV的感染模型进行中和试验,使检测过程更加安全、简单,结果评定更加直观、有效。经研究表明,200 pfu的VSV△G*CSFV可被150倍稀释的标准猪瘟阳性血清所中和,利用该方法检测10份现地待检样品,结果显示7份为阳性,3份为阴性,与商品化试剂盒检测结果的符合率为90%,表明该方法能够作为一种新型的检测工具,应用于猪瘟中和抗体检测。同时,本研究对传统利用重组VSV系统制备伪型病毒的方法进行改良,节省了制备的时间,减少了表达蛋白对细胞的损伤,提高了工作效率。关于CSFV致病机制的研究报道甚少,本研究用猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF感染敏感细胞PK-15不同的时间后,利用激光共聚焦显微镜观测E2蛋白在被感染细胞中的存在情况。分别对感染后10、20、35和60 min的PK-15细胞中E2的定位进行观测,结果表明:在被CSFV感染的过程中,E2蛋白先吸附在被感染细胞的细胞表面,逐渐进入到细胞内部,主要存在于细胞质中,不会进入到细胞核内,揭示了E2在CSFV的吸附与进入的过程中发挥关键作用。本研究为进一步研究猪瘟病毒的致病机制奠定基础。虽然猪瘟伪型病毒研制成本较高,难以实现规模化大批量生产,同时VSV△G*CSF的病毒滴度较野生型CSFV低,但因为其生物安全性好,且携带有报告基因便于定性或定量检测,故可以作为中和试验中CSFV的替代品,成为新型检测工具应用于猪瘟中和抗体的测定,使CSFV的抗体检测更加安全,直观,快速。同时将猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF作为引起主要保护性抗原E2基因的传递工具,用于研究被CSFV感染细胞中E2蛋白在病毒感染不同时间点的具体位置,动态的展现出E2蛋白从吸附到进入,以及感染剂量与感染时间的相互关系,为CSFV病毒感染细胞的研究提供参考。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-13
1 引言  13-35
  1.1 猪瘟病毒概述  13-14
  1.2 猪瘟病毒及其分类  14-15
  1.3 猪瘟病毒基因组与编码蛋白  15-17
  1.4 猪瘟病毒的结构蛋白  17-21
  1.5 猪瘟病毒的非结构蛋白  21-24
  1.6 猪瘟病毒的细胞表面受体  24-26
  1.7 猪瘟病毒的毒力相关基因  26-27
  1.8 猪瘟病毒的繁殖与装配  27-28
  1.9 猪瘟病毒诊断技术的研究进展  28-32
    1.9.1 猪瘟抗原诊断技术的研究进展  28-31
    1.9.2 猪瘟抗体诊断技术的研究进展  31-32
  1.10 伪型病毒的研究进展  32-34
    1.10.1 伪型病毒国外的研究现状  33-34
    1.10.2 伪型病毒国内的研究现状  34
  1.11 本研究的目的与意义  34-35
2 试验材料、流程与方法  35-51
  2.1 试验材料  35-38
    2.1.1 质粒  35
    2.1.2 细胞、病毒与抗体  35-36
    2.1.3 主要试剂、生物学软件  36-37
    2.1.4 主要仪器  37-38
  2.2 试验流程图  38-39
  2.3 试验方法  39-51
    2.3.1 目的蛋白的分析、表达与鉴定  39-44
    2.3.2 复制缺陷型病毒VSV△G*G 的制备  44-46
    2.3.3 猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF 的制备  46-49
    2.3.4 利用猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF 进行中和试验  49-50
    2.3.5 利用猪瘟伪型病毒对被感染细胞中E2 蛋白的定位进行研究  50-51
3 试验结果  51-67
  3.1 目的蛋白的分析、改造  51-53
    3.1.1 CSFV 囊膜蛋白的跨膜区预测分析  51-52
    3.1.2 CSFV 囊膜蛋白E2 的亲/疏水性、带电荷情况及其二级结构分析与 3D 模型的建立  52-53
  3.2 表达CSFV 全部囊膜蛋白重组表达质粒的获得与鉴定  53-55
  3.3 CSFV 囊膜蛋白E2 的部分缺失  55-56
    3.3.1 CSFV 囊膜蛋白E2 部分缺失重组表达质粒的获得与酶切鉴定  55
    3.3.2 重组蛋白的Western blot 分析与间接免疫荧光鉴定  55-56
  3.4 复制缺陷型病毒VSV△G*G 制备方法的改良  56-59
    3.4.1 转染质粒的提取、鉴定与浓度测定  56-57
    3.4.2 转染质粒pVSV-G 后G 蛋白的表达  57-58
    3.4.3 传统方法与改良方法制备的复制缺陷型病毒VSV△G*G  58
    3.4.4 利用两种方法制备复制缺陷型病毒VSV△G*G 的滴度比较  58
    3.4.5 存放条件对两种方法制备的复制缺陷型病毒滴度的影响分析  58-59
  3.5 利用改良方法进行猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF 的制备与毒价测定  59-60
  3.6 猪瘟伪型病毒的鉴定  60-63
    3.6.1 间接免疫荧光检测  60-61
    3.6.2 免疫电镜观测  61-62
    3.6.3 激光共聚焦检测  62-63
  3.7 利用猪瘟伪型病毒监检中和抗体方法的初步建立  63-66
    3.7.1 待检血清最佳稀释度的确立  63
    3.7.2 利用猪瘟伪型病毒VSV△G*CSF 对10 份现地样品进行中和试验  63-64
    3.7.3 与试剂盒检测10 份样品的结果进行比较  64-65
    3.7.4 特异性试验  65-66
  3.8 激光共聚焦检测不同时间CSFV 的囊膜蛋白E2 在被感染细胞中的定位  66-67
4 讨论  67-72
  4.1 猪瘟伪型病毒是一种安全、直观的中和抗体检测工具  67-68
  4.2 猪瘟囊膜蛋白E2 的锚定序列含有膜定位信号  68-70
  4.3 猪瘟伪型病毒是进行病毒基因传递的载体  70
  4.4 重组水疱性病毒系统成为伪型病毒的制备的有效工具  70-71
  4.5 改良方法能够提高了伪型病毒制备效率  71
  4.6 利用生物学软件分析能够题号试验的可行性  71-72
5 结论  72
6 展望  72-73
致谢  73-74
参考文献  74-84
作者简介  84-85

基于伪型病毒的猪瘟中和抗体检测方法的初步建立及猪瘟病毒E2蛋白的细胞定位研究

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