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双峰驼IgGs的提取、抗体制备及其分泌细胞在小肠分布规律的研究

作　者: 张旺东
导　师: 王雯慧; 刘磊
学　校: 甘肃农业大学
专　业: 基础兽医学
关键词: 双峰驼IgG 分离纯化多抗制备免疫组化小肠分布特点
分类号: S852.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

血清型IgGs是可溶性的糖蛋白，在体液免疫中发挥重要作用。而双峰驼血清型IgGs中除了常规结构的亚型IgG1之外，还含有天然缺失轻链的重链抗体IgG2和IgG3，并占总体含量的60～80%。由于它们独特的结构，使其具备了多种特殊的生物学功能。为了探讨双峰驼血清型IgGs分泌细胞在小肠中的分布特点以及与肠道黏膜免疫之间的关系，本研究主要由以下几个部分构成：采集了8峰健康的阿拉善双峰驼血清，分别对其血清/血浆使用饱和硫酸铵从20%的饱和度起，按照5%的饱和梯度逐渐加至60%，中间穿插静置离心步骤，把血清中的蛋白在硫酸铵的不同饱和度下进行初步分离，结合双峰驼血清型IgG的含量、分子量大小及结构特征，利用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳预测其所在含量最高的沉淀区间，确定双峰驼IgG的饱和硫酸有效沉淀范围。结果表明，将双峰驼血清经过一倍稀释，在35%～40%的饱和度下的沉淀物中含量最高，为IgG盐析沉淀的主要区间。将葡聚糖G-200凝胶层析柱和DEAE-52离子交换层析柱联合使用，用紫外光分光光度法检测洗脱液中的蛋白含量并绘制、分析洗脱曲线，结合双峰驼血清型IgG分子的理化特性，使用SDS聚丙烯凝胶电泳检测对35%饱和硫酸盐析物做进一步纯化。结果显示，两种纯化方法交替使用，相互补充，最后得到了高纯度的双峰驼血清型总IgG。采用皮下多点注射和部分淋巴结内以及耳缘静脉内等多种混合免疫方法对成年健康的雄性家兔进行免疫刺激，用琼脂板免疫双扩散实验进行效价检测。结果显示，在第三次免疫结束后其抗体效价达到1:512，符合预期实验目标，通过心脏采血采集免疫家兔的血液，收集血清并纯化抗体，得到较纯的兔抗双峰驼血清型IgG的多克隆抗体。运用解剖学及免疫组织化学的方法对成年健康双峰驼小肠进行观察、统计和分析。结果表明，在十二指肠部， IgG＋浆细胞主要分布于肠绒毛基部的固有层内，大多数以分散的形式分布，以肠腺周围分布居多，部分呈堆存在；十二指肠腺内也可见到零星的分布；而在上皮、淋巴滤泡、平滑肌层以及浆膜层并未发现IgG~+浆细胞分布；空肠和回肠的分布状况与十二指肠类似（十二指肠腺除外）。统计结果显示，从十二指肠膨大部到回肠末端，固有层内的IgG~+细胞密度呈逐渐减少的趋势。实验结果证明，双峰驼小肠固有层内存在较多的IgG分泌细胞，其分布密度从十二指肠至回肠末端逐渐降低，似乎与营养物质在小肠的吸收成正相关关系，从而间接证明，双峰驼血清型IgG在其消化道黏膜免疫反应中也发挥有重要作用。

全文目录

摘要  8-10
Summary  10-12
第一部分文献综述动物免疫球蛋白及其黏膜免疫的研究进展  12-27
  1 双峰驼种群特征  12
  2 免疫球蛋白的概述  12-19
    2.1 免疫球蛋白的结构和分类  13-14
    2.2 各类免疫球蛋白的理化性质  14-15
    2.3 免疫球蛋白的生物学功能  15-16
    2.5 免疫球蛋白的提取分离纯化  16-17
    2.6 蛋白质含量的测定  17-19
  3 双峰驼免疫球蛋白的理化性质及生物学功能  19-21
    3.1 双峰驼免疫球蛋白的理化性质  19-20
    3.2 双峰驼免疫球蛋重链抗体的生物学功能  20-21
  4 双峰驼肠道黏膜免疫  21-22
    4.1 基本构成  21-22
    4.2 肠道黏膜免疫免疫反应的机理  22
  5 本研究的目的和意义  22-23
  参考文献  23-27
第二部分实验研究  27-64
  第一章双峰驼血清总IgG分离纯化及抗血清制备  27-53
    实验一双峰驼血清总IgG的粗提取  27-37
      1 材料与方法  28-32
        1.1 实验材料  28
        1.2 主要试剂  28-30
        1.3 主要仪器  30
        1.4 双峰驼血清及血浆的制备  30
        1.5 牛血清白蛋白标准曲线绘制  30
        1.6 双峰驼血清蛋白的盐析  30-31
        1.7 蛋白浓度测量  31-32
        1.8 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳分析  32
      2 结果  32-34
        2.1 双峰驼血清及血浆的提取  32
        2.2 牛血清白蛋白标准曲线  32-33
        2.3 双峰驼血清蛋白盐析的电泳检测  33-34
      3 讨论  34-37
        3.1 提取条件对其品质的影响  34-35
        3.2 饱和度对双峰驼血清盐析的影响  35
        3.3 SDS蛋白质电泳对双峰驼IgG沉淀区间的预测  35-37
    实验二双峰驼血清总IgG的纯化  37-45
      1 材料与方法  37-40
        1.1 实验材料  37
        1.2 主要试剂  37-38
        1.3 主要仪器  38
        1.4 血清总IgG粗体物的纯化  38-40
        1.5 IgG验证及纯度检测  40
      2 结果  40-42
        2.1 Sephadex G-200 纯化结果  40-41
        2.2 DEAE-52 纯化结果  41-42
        2.3 电泳分析  42
      3 讨论  42-45
        3.1 凝胶层析对蛋白纯化的影响  42-43
        3.2 离子交换层析对蛋白纯化的影响  43-44
        3.3 电泳检测的结果分析  44-45
    实验三兔抗双峰驼血清IgG多克隆抗体的制备  45-50
      1 材料与方法  45-47
        1.1 实验材料  45
        1.2 主要试剂  45-46
        1.3 主要仪器  46
        1.4 免疫程序的制定  46-47
        1.6 免疫血清的采集  47
        1.7 免疫血清的粗提  47
        1.8 免疫血清的纯化  47
      2 结果  47-48
        2.1 抗体效价  47
        2.2 免疫血清的制备  47-48
        2.3 免疫血清的粗提及纯化  48
      3 讨论  48-50
        3.1 免疫程序对抗体效价的影响  48-49
        3.2 抗体效价的检测  49
        3.3 血液采集对抗体的影响  49
        3.4 抗体的粗提及纯化对抗体效价的影响  49-50
    参考文献  50-53
  第二章双峰驼IgG~+浆细胞在小肠中的分布及与黏膜免疫的关系  53-64
    1 材料与方法  54-56
      1.1 实验材料  54
      1.2 主要试剂  54-55
      1.3 主要仪器  55
      1.4 试验动物的处理  55
      1.5 制作石蜡切片  55
      1.6 免疫组化染色程序  55-56
      1.7 确定抗体的工作浓度  56
      1.8 观察方法  56
    2 结果  56-60
      2.1 抗体的特异性与工作浓度  56
      2.2 IgG~+浆细胞在十二指肠的分布特点  56-57
      2.3 IgG~+浆细胞在空肠的分布特点  57-58
      2.4 IgG~+浆细胞在回肠的分布特点  58-59
      2.5 IgG~+浆细胞在小肠固有层内的统计结果  59-60
    3 讨论  60-63
      3.1 免疫组化染色程序对结果的影响  60
      3.2 IgG在黏膜免疫中的作用  60
      3.3 IgG型浆细胞在黏膜中的分布特征  60-61
      3.4 分布特点与其生理功能的关系  61
      3.5 分布特点与黏膜免疫的关系  61-63
    参考文献  63-64
全文结论  64-65
附图  65-69
致谢  69-70
个人简介  70-71
导师简介  71-72

双峰驼IgGs的提取、抗体制备及其分泌细胞在小肠分布规律的研究

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