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矮化大豆GmEXPA41基因的克隆及功能分析

作　者: 任明玄
导　师: 胡宝忠
学　校: 东北农业大学
专　业: 植物学
关键词: 矮化大豆 膨胀素 基因克隆 原核表达 结构预测
分类号: S565.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
下　载: 37次
引　用: 1次
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内容摘要


大豆是世界五大作物之一,是非常重要的植物蛋白质和食用油资源,也是重要的优质工业原料,大豆的综合利用和开发受到了世界各国重视。然而,近年来我国大豆生产却增长缓慢,已经不能满足国内大豆需求。为解决这一矛盾,必须提高大豆产量、优化大豆种植,而矮化大豆的研究有利于优势大豆的种植、提高大豆的产量,满足中国大豆日益增长的需求量。而许多文献表明,膨胀素(expansin)基因可能与植株的高矮相关,所以对矮化大豆expansin的研究有利于我们在分子水平上研究大豆表型的成因,为大豆的分子育种奠定基础。本文克隆了矮化大豆的膨胀素GmEXPA41基因的全长序列,对其进行信息学分析,最后将矮化大豆的expansin基因构建到了大肠杆菌的表达载体pET32a中,转化到了大肠杆菌BL21(DE3)中,进行了原核表达,经过SDS-PAGE分析,筛选了高产菌株,并借助发酵罐对其进行发酵培养,为后期矮化大豆膨胀素的分离纯化、结构解析和功能验证奠定了基础。具体研究结果如下：1.通过序列比对设计了矮化大豆膨胀素基因的保守区引物,利用PCR技术克隆得到了765bp的膨胀素基因的CDS。再通过5’RACE和3’RACE进行PCR扩增分别得到804bp和828bp的基因,最后将三段基因进行拼接获得了矮化大豆GmEXPA41mRNA的全长序列。通过NCBI中的blast比较,发现该序列为新序列,将其提交genebank,得到登陆号为JF694991。2.膨胀素GmEXPA41基因进行分析表明,基因的CDS大小为765bp,共编码254个氨基酸。与正常大豆氨基酸序列的同源性为96.47%。进行二级结构预测和比较,结果发现矮化大豆的膨胀素蛋白比正常大豆的膨胀素蛋白多了一个α螺旋。通过计算机同源模型获得了矮化大豆以及正常大豆膨胀素蛋白的三维结构,发现矮化大豆的膨胀素蛋白比正常大豆的膨胀素蛋白的β折叠要略少一些。另外,以正常大豆expansin蛋白为受体进行了分子对接模拟,找到与正常大豆的膨胀素蛋白结合较好的10个化合物,并模拟了它们的结合方式,初步研究了一些化合物与膨胀素蛋白的相互作用。3.构建了大肠杆菌重组菌[pET32a-expansin BL21(DE3)],并且得到了高效表达菌株2号。4.利用高效表达2号菌株为出发菌株,进行试管和三角瓶培养,然后以10%的接种量转接到3L的发酵罐中,温度为37度,初始转速为100rpm,通气量为150L.h-1。经过3h培养后,将转速与溶氧量进行关联,当A600为15时,加入终浓度为1mM的IPTG进行诱导,继续培养4h后,离心收集菌体,最终发酵得到菌体湿重94.66g。

全文目录


摘要  8-9
Abstract  9-11
1 前言  11-22
  1.1 大豆概况  11-13
  1.2 膨胀素  13-17
    1.2.1 膨胀素的发现  13
    1.2.2 膨胀素的结构及其基因家族  13-14
    1.2.3 膨胀素的调节机制  14-15
    1.2.4 膨胀素的功能分析  15-16
    1.2.5 矮化植物的研究进展  16-17
  1.3 基因克隆  17-19
    1.3.1 基因克隆技术  17
    1.3.2 RACE技术  17-18
    1.3.3 蛋白质三维结构的预测方法  18-19
  1.4 基因重组菌的发酵罐发酵  19-20
  1.5 研究目的和意义  20
  1.6 技术路线  20-22
2 材料与方法  22-32
  2.1 材料  22-24
    2.1.1 供试材料  22
    2.1.2 菌株与质粒  22
    2.1.3 生物学试剂及常规化学试剂  22
    2.1.4 缓冲液及主要试剂的配制  22-23
    2.1.5 细菌培养基  23-24
    2.1.6 主要仪器  24
  2.2 方法  24-32
    2.2.1 矮化大豆HK808膨胀素(expansin)基因的克隆  24-28
    2.2.2 矮化大豆expansin基因的生物信息学研究  28
    2.2.3 大肠杆菌表达载体的构建  28-29
    2.2.4 重组质粒在大肠杆菌BL21(DE3)中的表达  29-31
    2.2.5 发酵罐的发酵验证  31-32
3 结果与分析  32-49
  3.1 RNA提取及检测  32
  3.2 中间片段的克隆  32-34
    3.2.1 expansin基因的获得  32-33
    3.2.2 测序分析  33-34
  3.3 5’RACE克隆  34-35
  3.4 3’RACE克隆  35
  3.5 全长基因拼接  35-37
  3.6 矮化大豆expansin基因的生物信息学研究  37-42
    3.6.1 矮化大豆与正常大豆氨expansin酸序列的比较  37-38
    3.6.2 矮化大豆expansin与正常大豆expansin的二级结构比较  38-39
    3.6.3 矮化大豆expansin与正常大豆expansin的三级结构预测及比较  39-40
    3.6.4 正常大豆expansin与drugbank数据库的药物结合模拟  40
    3.6.5 10种化合物与正常大豆expansin的结合方式  40-42
  3.7 目的基因在大肠杆菌(DE3)中的表达  42-45
    3.7.1 目的基因的获得  42
    3.7.2 表达载体的构建及鉴定  42-45
    3.7.3 目的基因在大肠杆菌中的表达  45
  3.8 发酵罐发酵研究  45-49
    3.8.1 高效表达菌株的筛选  45-46
    3.8.2 发酵罐发酵实验  46-49
4 讨论  49-53
  4.1 矮化大豆膨胀素基因的分析  49
  4.2 矮化大豆膨胀素基因在原核生物大肠杆菌中的表达  49-50
  4.3 蛋白预测分析  50-51
  4.4 药物筛选  51-52
  4.5 发酵罐的应用  52-53
5 结论  53-54
致谢  54-55
参考文献  55-60
攻读学位期间发表的学术论文  60

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 油料作物 > 大豆
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