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马铃薯内生菌的分离纯化及其对马铃薯生长发育的影响

作　者: 王剑峰
导　师: 马建忠
学　校: 兰州理工大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 马铃薯LK99 内生细菌植物-微生物相互作用根生长抑制
分类号: S532
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

植物内生菌（Endophytic fungi）作为一类特殊生境的微生物资源，广泛分布于苔藓植物、蕨类植物、裸子植物以及被子植物类群中，经过与宿主植物的长期协同进化，它们能够产生与宿主植物结构相同或相似的化学物质，并且影响着植物的生长发育。本文以马铃薯LK99(Solanum tuberosum L. cv. LK99)组培苗为材料，对马铃薯LK99组培苗内生菌及其对马铃薯LK99组培苗生长发育的影响进行了初步研究，取得了以下结果：1.取生长15天马铃薯LK99组培苗，剪成长度约1.0cm的带腋芽茎段，接种于马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）和MS培养基上，于光下（2200Lx、16hr光/8hr黑暗、28℃）和28℃暗培养。3天后，光下或黑暗条件下生长在PSA培养基上的组培苗周围均出现了黄色的菌块，而光下或黑暗条件下生长在MS培养基上的组培苗周围均无菌块的出现。经单菌落分离、内生菌的生理生化试验及16S rDNA片段的扩增和序列分析得知：光下生长于PSA培养基上的组培苗周围出现的菌斑分离到2种细菌，分属于Bacillus sp.和Bacillus subtilis，命名为Bacillus sp. LW01和Bacillus subtilis LS01。黑暗条件下生长于PSA培养基上的组培苗周围出现的菌斑分离到2种细菌，分属于Leifsonia sp.和Bacillus sp.，命名为Leifsonia sp. DH01和Bacillus sp. DW01。2.取生长15天马铃薯LK99组培苗，剪成长度约1.0cm的带腋芽茎段，接种于MS培养基上，于光下（2200Lx、16hr光/8hr黑暗、28℃）培养5周左右，加入25mL液体MS培养基于组培瓶，黑暗22℃培养5周左右以结薯。选取直径为1.5cm的微型薯，一切为二，将切面置于马铃薯蔗糖琼脂培养基（PSA）或MS培养基表面，于光下（2200Lx、16hr光/8hr黑暗、28℃）或28℃暗培养。3天后，光下或黑暗条件下生长在PSA培养基上的微型薯周围均出现了黄色的菌块，而光下或黑暗条件下生长在MS培养基上的微型薯周围均无菌块出现。经单菌落分离、内生菌的生理生化实验分析及16S rDNA片段的扩增和序列分析得知：光下生长于PSA培养基上的微型薯周围出现的菌块分离到2种细菌，分属于Bacillus subtilis和Bacillus sp.，命名为Bacillus subtilis SLH01和Bacillus sp. SLB01。黑暗条件下生长于PSA培养基上的组培苗周围出现的菌块分离到1种细菌，属于Bacillus sp.，命名为Bacillus sp. SDB01。3.培养分离得到的7种内生菌，待内生菌OD600长至0.5时，将组培苗茎段在菌液中浸没，立刻取出转入含MS培养基的组培瓶于28℃、2200Lx、16hr光/8hr黑暗条件下培养。DH01菌株和LW01菌株在MS培养基上没有菌落长出。在第3周时，DH01菌株和LW01菌株对组培苗株高的抑制最明显。DH01菌株处理的组培苗，在光下培养5周后的组培苗表现出主根很短、粗壮且无侧根形成，根色为黑褐色。对照组组培苗的根细长茂盛，略带绿色，侧根发达。DH01菌株处理组整株平均鲜重比对照组降低了1.45%，单株平均地上部分鲜重比对照组增加了15.63%，根平均鲜重比对照组降低了40.48％。整株平均干重、单株平均地上部分干重比对照组分别增加了6.93%、241.30%，根平均干重比对照组降低了471.43%。以上数据表明，DH01菌株对根有明显的抑制作用，但是对地上部生物量的积累有明显的促进作用。LW01菌株浸染组培苗，经5周在光下培养，组培苗的根细长，略带绿色，侧根发达，与对照组组培苗的根没有明显的区别，整株平均鲜重比对照组降低了13.9%，单株平均地上部分鲜重比对照组降低了17.9%，根平均鲜重比对照组降低了3.1％。整株平均干重、单株平均地上部分干重比对照组分别增加了8.7%、8.8%，根平均干重比对照组增加了8.8%，以上数据表明，LW01菌株对生物量的积累起到促进作用，但对鲜重的积累起到抑制作用。DW01菌株和LS01菌株在其OD600低至0.18时浸染组培苗，均可在1～2天内在马铃薯蔗糖培养基上大量生长，最终导致组培苗死亡。SLH01菌株处理组培苗，在光下培养5周后，其SLH01处理组单株平均地上部分鲜重比对照组增加了33.63%，单株平均根鲜重比对照组降低了73.78%，单株平均地上部分干重比对照组增加了50.85%，单株平均根干重比对照组降低了29.75%。SDB01处理组培苗，在光下培养5周后，其SDB01处理组单株平均地上部分鲜重比对照组增加了103.84%，单株平均根鲜重比对照组降低了69.80%，单株平均地上部分干重比对照组增加了106.76%，单株平均根干重比对照组降低了62.75%。SLH01菌株和SDB01菌株浸染组培苗，在光下培养5周后的组培苗表现出主根很短、粗壮且无侧根形成，根色为黑褐色，且浸染部位膨大，对照组组培苗的根细长茂盛，略带绿色，侧根发达。结果表明，SLH01菌株和SDB01菌株对生物量的积累都有促进作用，但对根的发育有明显的抑制作用，SLB01菌株在其OD600低至0.18时浸染组培苗，均可在1～2天内在马铃薯蔗糖培养基上大量生长，最终导致组培苗死亡。

全文目录

目录  5-8
摘要  8-10
Abstract  10-13
常用英文缩写词  13-14
第1章绪论  14-25
  1.1 植物内生菌研究概况  14-24
    1.1.1 内生菌的定义  14-15
    1.1.2 内生菌的起源与演化  15-16
    1.1.3 植物内生菌与宿主植物之间的关系  16-17
    1.1.4 植物内生菌的生物学意义  17-19
    1.1.5 内生菌的普遍存在性与生物多样性  19
    1.1.6 植物内生菌产活性物质研究概况  19-22
    1.1.7 植物内生菌的应用研究  22-23
    1.1.8 内生菌研究内容、存在问题与展望  23-24
  1.2 马铃薯的研究现状  24
    1.2.1 马铃薯概况  24
  1.3 本课题的研究内容、目的和意义  24-25
第2章马铃薯组培苗茎段内生菌的分离纯化及其对马铃薯生长发育的影响  25-35
  2.1 实验材料  25-27
    2.1.1 植物材料  25
    2.1.2 药品与仪器  25-27
    2.1.3 培养基  27
  2.2 实验方法  27-28
    2.2.1 马铃薯 LK99 组培苗的培养  27
    2.2.2 马铃薯内生菌单菌落的分离  27
    2.2.3 马铃薯内生菌的革兰氏染色试验、甲基红试验、吲哚试验、乙酰甲基甲醇试验和糖发酵试验  27-28
    2.2.4 马铃薯内生菌 16S rDNA 基因的扩增及序列分析  28
    2.2.5 马铃薯内生菌浸染组培苗对其生长发育的影响  28
  2.3 结果与分析  28-33
    2.3.1 光下和黑暗条件下马铃薯组培苗与内生菌的生长状况  28-30
    2.3.2 马铃薯内生菌的革兰氏染色和生理生化性质分析  30-31
    2.3.3 马铃薯内生菌单菌落的分离及16S rDNA片段的扩增和序列分析  31
    2.3.4 马铃薯内生菌对组培苗生长发育的影响  31-33
  2.4 讨论  33-35
第3章微型薯内生菌的分离纯化及其对马铃薯生长发育的影响  35-45
  3.1 实验材料  35-37
    3.1.1 植物材料  35
    3.1.2 药品与仪器  35-37
    3.1.3 培养基  37
  3.2 实验方法  37-38
    3.2.1 马铃薯 LK99 微型薯的培养  37
    3.2.2 马铃薯 LK99 微型薯内生菌单菌落的分离  37-38
    3.2.3 马铃薯 LK99 微型薯内生菌的革兰氏染色试验、甲基红试验、吲哚试验和乙酰甲基甲醇试验和糖发酵试验  38
    3.2.4 马铃薯 LK99 微型薯内生菌 16S rDNA基因的扩增及序列分析  38
    3.2.5 马铃薯 LK99 微型薯内生菌浸染组培苗对其生长发育的影响  38
  3.3 结果与分析  38-43
    3.3.1 光下和黑暗条件下马铃薯LK99微型薯与内生菌的生长状况  38-39
    3.3.2 马铃薯 LK99 微型薯内生菌的革兰氏染色和生理生化性质分析  39-40
    3.3.3 马铃薯 LK99 微型薯内生菌单菌落的分离及 16S rDNA片段的扩增和序列分析  40-41
    3.3.4 马铃薯 LK99 微型薯内生菌对组培苗生长发育的影响  41-43
  3.4 讨论  43-45
第4章马铃薯内生菌的系统发育分析及分子生物学特性  45-54
  4.1 实验材料  45-47
    4.1.1 菌株及培养基  45
    4.1.2 药品与试剂配制  45-46
    4.1.3 实验仪器  46-47
  4.2 实验方法  47-48
    4.2.1 内生菌菌落形态及显微结构观察  47
    4.2.2 内生菌菌株分子生物学鉴定  47-48
  4.3 结果与分析  48-52
    4.3.1 内生菌菌落形态及显微形态观察  48-49
    4.3.2 分子生物学方法对内生菌菌株的分析鉴定  49-52
  4.4 讨论  52-54
结论与展望  54-55
参考文献  55-61
致谢  61-62
附录 A （攻读硕士学位期间所发表的论文及成果）  62-63
附录 B （马铃薯内生菌 16s rRNA部分序列）  63-65

马铃薯内生菌的分离纯化及其对马铃薯生长发育的影响

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