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具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌对植物的解盐促生作用及其ACC脱氨酶基因的克隆

作　者: 滕松山
导　师: 赵蕾
学　校: 山东师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 碱蓬 ACC脱氨酶 内生细菌 解盐促生 基因克隆
分类号: S156.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


碱蓬(Suaeda salsa)是一种生长于盐碱地和海滨沙滩的耐盐性极强的盐生植物,在我国分布广泛,是当前生物改良盐渍土的首选植物品种。大量研究证明,碱蓬的耐盐能力主要源自耐盐关键基因的表达或调节,而碱蓬内生菌的多样性及其对碱蓬的生长及生理功能的影响却长期处于被忽视的地位。众所周知,生物之间的共生是一种极为普遍的生命活动和生态现象,大部分植物内生菌都是植物物种进化的结果,即内生菌通过与宿主植物的相互作用,使植物能够在特定环境下生长、繁殖。有研究表明,感染内生真菌的植物具有较高的抗逆境胁迫的能力,而一些具有1-氨基环丙烷-1-羧酸(ACC)脱氨酶活性的内生细菌在促进宿主植物的生长及抗重金属胁迫中也起到了作用,该酶是通过催化乙烯的关键中间前体物质ACC转化成α-丁酮酸来降低乙烯水平,从而缓解逆境胁迫产生的乙烯对植物造成的不良影响。为深入探讨处于高盐环境中碱蓬内生细菌的生态作用,本文从分离、筛选具ACC脱氨酶活性的碱蓬内生细菌入手,对分离到的菌株测定其生物学特性并进行生理生化及分子生物学水平的鉴定,然后通过种子萌发试验及盆栽试验对菌株的解盐促生效果作初步评价,最后对其ACC脱氨酶基因进行克隆并进行生物信息学分析。具体结果如下:1.从山东东营健康碱蓬植株体内分离筛选到具有较高ACC脱氨酶活力的内生细菌LP11、SS12、TW1及TW2,4株菌还可不同程度地产生铁载体、吲哚乙酸、赤霉素和脱落酸,且均有溶磷作用,但无固氮能力及蛋白酶活力,唯有菌株SS12对萝卜枯萎病菌(Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans)和黄瓜枯萎病菌(F. oxysporum f. sp. cucumerinum)具有拮抗作用。根据形态特征、生理生化、API鉴定系统和16S rRNA将其分别鉴定为栖稻假单胞菌(Pseudomonas oryzihabitans)、假单胞菌(Pseudomonas sp.)、成团泛菌(Pantoea agglomerans)和恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)。2.通过种子萌发试验及盆栽试验研究了不同NaCl浓度胁迫下菌株LP11对不同植物的解盐促生作用。结果表明,菌株LP11不仅能促进宿主碱蓬种子的萌发,还有助于非盐生植物黄瓜及油菜种子的萌发,且经LP11菌悬液处理的种子的芽长与未接菌的处理相比均有一定程度的增加; LP11还可显著促进不同盐浓度条件下黄瓜与玉米植株的生长,其根长、叶长、株高及鲜重与相应对照比较亦有一定程度的增加;除此之外,LP11能够促进黄瓜和玉米植株合成叶绿素、可溶性糖及脯氨酸,从而增强植物的抗逆能力。3.本实验对菌株LP11的ACC脱氨酶基因进行了克隆,可为今后将ACC脱氨酶基因转化植物、从而增强植物的抗逆性奠定基础。应用CODEHOP法扩增菌株LP11 ACC脱氨酶基因的保守序列,再通过染色体步移法获得该基因已知区域5’及3’端的非保守的未知区域,最后根据拼接的序列设计引物,通过PCR扩增获得acdS基因的完整编码区。测序结果显示,该片段长996 bp,通过Blast搜索及系统发育分析表明菌株LP11的acdS基因与Pseudomonas fluorescens SBW25的acdS基因亲缘关系最近,其编码的AcdS蛋白亦与后者编码产物同源性最高。最后用SWISS-MODEL软件对该ACC脱氨酶的三维结构进行了预测展示。

全文目录


中文摘要  8-10
ABSTRACT  10-12
第一章 文献综述  12-33
  1 盐胁迫对植物的危害及植物耐盐机理  12-16
    1.1 盐胁迫对植物的危害  12-13
      1.1.1 盐胁迫对植物种子萌发的影响  12
      1.1.2 盐胁迫对植物生长的影响  12-13
      1.1.3 盐胁迫对植物光合作用的影响  13
      1.1.4 盐胁迫对植物呼吸作用的影响  13
    1.2 盐生植物的耐盐机理  13-15
      1.2.1 植物对离子的选择性吸收和转运  13-14
      1.2.2 盐分离子的区域化  14
      1.2.3 渗透调节  14
      1.2.4 植物激素调节  14-15
      1.2.5 耐盐相关基因的表达与调控  15
    1.3 碱蓬的耐盐机理  15-16
  2 植物内生细菌的多样性及对宿主植物的作用  16-19
    2.1 植物内生细菌的多样性  16-17
      2.1.1 宿主植物种类分布多样  16-17
      2.1.2 内生细菌自身种类分布多样  17
      2.1.3 内生细菌在植物组织中分布多样  17
    2.2 内生细菌对宿主植物的作用  17-19
      2.2.1 内生细菌对宿主植物的促生作用  17-18
      2.2.2 内生细菌对宿主植物的生防作用  18
      2.2.3 内生细菌对宿主植物的抗逆作用  18-19
  3 具ACC 脱氨酶活性的微生物对植物的解盐促生作用  19-25
    3.1 ACC 脱氨酶的生物化学特性  19-20
    3.2 ACC 脱氨酶的蛋白质结构  20-23
    3.3 具ACC 脱氨酶活性的微生物对植物的作用  23-24
    3.4 具ACC 脱氨酶活性的微生物的解盐促生机理  24-25
  4 ACC 脱氨酶基因研究进展  25-30
    4.1 ACC 脱氨酶基因的分布  25-28
    4.2 ACC 脱氨酶基因的调控  28-29
    4.3 ACC 脱氨酶基因的遗传  29-30
    4.4 ACC 脱氨酶基因的表达水平  30
    4.5 ACC 脱氨酶基因转基因植物  30
  5 本研究的立题依据、研究内容及技术路线  30-33
    5.1 立题依据  30-31
    5.2 研究内容  31-32
    5.3 技术路线  32-33
第二章 具ACC 脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离、鉴定及其生物学特性  33-54
  1 材料与方法  33-39
    1.1 实验材料  33-36
      1.1.1 植物材料  33
      1.1.2 病原真菌  33
      1.1.3 培养基  33-35
        1.1.3.1 PAF 培养基  33-34
        1.1.3.2 DF 培养基  34
        1.1.3.3 ADF 培养基  34
        1.1.3.4 TSB 培养基  34
        1.1.3.5 PKO 培养基  34
        1.1.3.6 LNM 培养基  34
        1.1.3.7 Ashby 培养基  34-35
        1.1.3.8 Nfb 培养基  35
        1.1.3.9 改良PDA 培养基  35
      1.1.4 主要仪器和试剂  35-36
        1.1.4.1 仪器设备  35
        1.1.4.2 试剂  35-36
    1.2 实验方法  36-39
      1.2.1 具ACC 脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的富集和分离  36
      1.2.2 ACC 脱氨酶活性检测  36-37
      1.2.3 菌株的生长曲线测定  37
        1.2.3.1 菌株在不同浓度NaCl 的ADF 培养基中的生长曲线  37
        1.2.3.2 菌株在不同pH 的ADF 培养基中的生长曲线  37
      1.2.4 菌株的生物学特性  37-38
        1.2.4.1 溶磷能力  37
        1.2.4.2 嗜铁素含量  37-38
        1.2.4.3 固氮活性  38
        1.2.4.4 吲哚乙酸（IAA）、赤霉素（GA3）和脱落酸（ABA）含量  38
        1.2.4.5 拮抗作用  38
        1.2.4.6 蛋白酶活性  38
      1.2.5 菌种鉴定  38-39
        1.2.5.1 生理生化鉴定  38-39
        1.2.5.2 API 系统鉴定  39
        1.2.5.3 16S rRNA 序列扩增和序列分析  39
  2 结果与分析  39-51
    2.1 具ACC 脱氨酶活性的碱蓬内生细菌的分离筛选  39
    2.2 菌株的生物学特性  39-42
    2.3 菌株的生长曲线  42-44
    2.4 菌种鉴定  44-51
      2.4.1 形态和生理生化鉴定结果  44
      2.4.2 API 系统鉴定结果  44-45
      2.4.3 16S rRNA 基因的序列分析结果  45-51
  3 讨论  51-54
    3.1 盐生植物碱蓬内生细菌的多样性  51
    3.2 内生细菌的API 系统鉴定  51-52
    3.3 碱蓬内生细菌丰富的生物学特性  52-54
第三章 具ACC 脱氨酶活性的碱蓬内生细菌LP11 解盐促生效果的初步评价..  54-69
  1 材料与方法  54-59
    1.1 实验材料  54-55
      1.1.1 供试植物  54
      1.1.2 供试菌株  54
      1.1.3 培养基  54
      1.1.4 主要仪器和试剂  54-55
        1.1.4.1 仪器设备  54-55
        1.1.4.2 试剂  55
    1.2 实验方法  55-59
      1.2.1 LP11 对种子萌发的影响  55
      1.2.2 LP11 对盐胁迫下黄瓜及玉米植株生长的影响  55-56
      1.2.3 盐胁迫下植株相关抗逆指标的测定  56-58
        1.2.3.1 叶绿素含量的测定  56-57
        1.2.3.2 可溶性糖含量的测定  57-58
        1.2.3.3 脯氨酸含量的测定  58
      1.2.4 数据分析方法  58-59
  2 结果与分析  59-67
    2.1 LP11 对盐胁迫下种子萌发的影响  59-61
    2.2 LP11 对盐胁迫下植物生长的影响  61-64
    2.3 LP11 对盐胁迫下植株叶绿素、可溶性糖及脯氨酸含量的影响  64-67
  3 讨论  67-69
第四章 具ACC 脱氨酶活性的碱蓬内生细菌LP11ACC 脱氨酶基因的克隆及序列分析  69-102
  1 材料与方法  69-78
    1.1 实验材料  69-70
      1.1.1 供试菌株  69
      1.1.2 主要仪器和试剂  69-70
        1.1.2.1 仪器设备  69
        1.1.2.2 试剂  69-70
    1.2 实验方法  70-78
      1.2.1 CODEHOP 法扩增菌株LP11 acdS 基因的部分序列  70-74
        1.2.1.1 菌株LP11 基因组DNA 的提取  70-71
        1.2.1.2 引物设计与合成  71
        1.2.1.3 acdS 基因的部分序列的扩增  71
        1.2.1.4 PCR 产物回收  71-72
        1.2.1.5 胶回收产物与pMD 18-T Vector 的连接  72
        1.2.1.6 感受态细胞E. coli DH5α的转化  72-73
        1.2.1.7 重组子的鉴定与测序  73-74
      1.2.2 Genome Walking 法获取菌株LP11 acdS 基因的旁侧非保守区域  74-76
        1.2.2.1 特异引物设计  74
        1.2.2.2 染色体步移  74-76
      1.2.3 菌株LP11 acdS 基因的克隆  76-78
        1.2.3.1 菌株LP11 基因组DNA 的提取  76
        1.2.3.2 引物设计与合成  76-77
        1.2.3.3 acdS 基因的PCR 扩增  77
        1.2.3.4 PCR 产物回收  77
        1.2.3.5 胶回收产物与pMD 18-T Vector 的连接  77
        1.2.3.6 感受态细胞E. coli DH5α的转化  77
        1.2.3.7 重组子的鉴定与测序  77-78
      1.2.4 菌株LP11 acdS 基因序列的生物信息学分析  78
  2 结果与分析  78-97
    2.1 菌株LP11 acdS 基因保守区域的获得  78-82
    2.2 菌株LP11 acdS 基因的旁侧非保守区域的获得  82-83
    2.3 菌株LP11 acdS 基因的克隆  83-86
    2.4 菌株LP11 acdS 基因序列的生物信息学分析  86-97
      2.4.1 菌株LP11 acdS 基因的核苷酸序列分析  86-91
      2.4.2 菌株LP11 AcdS 蛋白的氨基酸序列分析  91-95
      2.4.3 菌株LP11 AcdS 蛋白的结构预测  95-97
  3 讨论  97-102
    3.1 用CODEHOP 设计简并引物扩增未知物种的目的基因  97-98
    3.2 用染色体步移技术(Genome Walking)获取与已知序列相邻的未知序列.  98-100
    3.3 acdS 基因的系统发育分析  100-102
第五章 结论  102-103
参考文献  103-113
致谢  113-114
攻读学位期间发表论文情况  114

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中图分类: > 农业科学 > 农业基础科学 > 土壤学 > 土壤改良 > 盐碱土改良
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