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西瓜内生细菌JK-3菌株的种类鉴定及其拮抗机理的初步研究

作　者: 陈文俊
导　师: 童蕴慧；戴富明
学　校: 扬州大学
专　业: 植物病理学
关键词: 西瓜 内生细菌 多粘类芽孢杆菌 拮抗机理 生防作用
分类号: S476
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


JK-3菌株是从西瓜根部筛选得到的一种革兰氏阳性菌,大小为3.0~4.2μm×0.7~1.0μm,菌落呈淡黄色、圆形、隆起、无褶皱、边缘整齐。扫描电镜观察,该菌周生鞭毛,卵圆形芽孢,孢囊膨大。培养4d后菌落表面有较多粘性物质生成。过氧化氢酶反应、硝酸盐反应呈阳性;氧化酶反应、甲基红反应呈阴性。该菌株为兼性厌氧菌,可以水解淀粉和酪蛋白,无法利用柠檬酸盐和丙二酸盐。该菌株基因组DNA用16S rDNA通用引物PCR扩增,得到1463bp的唯一扩增产物,经NCBI的Blastn比对结果发现,JK-3菌株的16SrDNA序列与G-14(登录号为:EU434620.1)等多粘类芽孢杆菌菌株的序列相似度达到100%。后经过BIOLOG微生物鉴定系统测定,得到了最为匹配的数据Species ID:Paenibacillus polymyxa,即多粘类芽孢杆菌。可能性为100,相似度0.867,结合分子鉴定结果及其常规生理生化特性可以鉴定JK-3菌株为多粘类芽孢杆菌。JK-3菌株与测试植物病原真菌的PDA平板对峙培养结果表明:JK-3菌株对8种不同的供试植物病原真菌均具有良好的拮抗作用,其中对番茄灰霉病菌表现出最强的抑制作用,抑菌圈直径达到28mm,对其它多种病原菌也有良好的抑制作用,表明JK-3菌株的拮抗谱较广。JK-3菌株的菌液以及其无菌滤液对西瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用,结果显示菌液及无菌滤液对西瓜枯萎病菌的孢子萌发均有明显的抑制作用,表明该菌株可以通过分泌抗生物质来抑制西瓜枯萎病菌孢子的萌发。盆栽防效试验证明JK-3菌株保护处理可以显著降低西瓜枯萎病菌侵染导致的幼苗发病率和致死率,防效分别达74.6%和94.8%的,进一步证明了JK-3菌株良好的拮抗性,具有较好的开发应用价值。JK-3菌株培养滤液以70%硫酸铵沉淀和透析,获得抗菌粗蛋白。该抗菌蛋白对西瓜枯萎病菌和西瓜蔓枯病菌具有明显的抑制作用。另外该抗菌蛋白对热不稳定,但对紫外线、氯仿、蛋白酶K都不敏感。经测定,蛋白组分内无α-氨基酸和苯环结构,不含脂,但是含有糖类,因而是糖蛋白。

全文目录


摘要  6-8
ABSTRACT  8-10
第一章 文献综述  10-21
  1 植物内生菌的概述  10-11
  2 内生细菌的种类和寄主范围  11
  3 植物内生细菌的生物学作用及其机制  11-16
    3.1 促生作用  11-12
    3.2 生防作用  12-15
      3.2.1 抗菌物质的产生  13-14
      3.2.2 生态位和营养竞争  14
      3.2.3 诱导系统抗性  14-15
    3.3 在非豆科植物中内生固氮作用  15
    3.4 可作为外源基因的载体  15-16
  4 植物内生细菌应用前景及存在的问题  16-17
  5 植物细菌分类鉴定的方法  17-20
    5.1 植物细菌常规鉴定方法  17-18
    5.2 植物细菌的数值分类方法（自动化鉴定）  18-19
    5.3 植物细菌化学分类鉴定法  19
    5.4 植物细菌分子生物学鉴定方法  19-20
  6 研究的目的与意义  20-21
第二章 西瓜内生细菌JK-3 菌株的常规方法鉴定  21-31
  1 材料与方法  21-26
    1.1 试验菌株  21
    1.2 试验仪器  21
    1.3 JK-3 菌株的形态观察  21-22
      1.3.1 菌落形态的观察及革兰氏染色  21
      1.3.2 JK-3 菌体的电镜观察  21-22
    1.4 JK-3 菌株生长条件的测定  22-23
      1.4.1 最适生长温度的测定  22
      1.4.2 最适pH 值的测定  22
      1.4.3 生长曲线的测定  22
      1.4.4 耐盐性的测定  22-23
      1.4.5 好氧性和厌氧性的测定  23
      1.4.6 抗生素敏感性的测定  23
    1.5 JK-3 菌株生化性状的测定  23-26
      1.5.1 碳素化合物的利用和分解  23-24
      1.5.2 氮素化合物的利用和分解  24-25
      1.5.3 大分子化合物的分解  25
      1.5.4 其他反应测定  25-26
  2 结果与分析  26-30
    2.1 菌落形态特征  26
    2.2 JK-3 菌株的电镜观察  26
    2.3 JK-3 菌株的生长特性  26-29
      2.3.1 最适生长温度  26-27
      2.3.2 最适pH 值  27-28
      2.3.3 生长曲线  28
      2.3.4 耐盐性  28-29
      2.3.5 对抗生素的敏感性  29
    2.4 JK-3 菌株的生理生化性状  29-30
  3 小结与讨论  30-31
第三章 JK-3 菌株的分子鉴定  31-37
  1 材料与方法  31-33
    1.1 酶和试剂  31
    1.2 通用引物  31
    1.3 JK-3 菌株基因组DNA 的小量制备  31-32
    1.4 16SrDNA 基因序列的PCR 扩增  32-33
    1.5 DNA 序列测定和序列同源性比较  33
  2 结果与分析  33-36
    2.1 JK-3 菌株16SrDNA 的PCR 扩增  33-34
    2.2 16SrDNA 序列测定结果  34
    2.3 用BLAST 程序组进行序列相似性搜索  34-35
    2.4 JK-3 菌株系统进化树的构建  35-36
  3 小结与讨论  36-37
第四章 JK-3 菌株的BIOLOG 自动化鉴定  37-42
  1 材料与方法  37-40
    1.1 培养基及接种液  37
    1.2 主要仪器及耗材  37
    1.3 选择合适的鉴定流程  37-38
    1.4 平板扩大培养  38-39
    1.5 制备悬浊液及接种培养  39-40
      1.5.1 悬浊液的制备  39
      1.5.2 悬浊液的调整  39-40
      1.5.3 接种培养  40
    1.6 读数仪读取结果  40
  2 结果与分析  40-41
  3 小结与讨论  41-42
第五章 JK-3 菌株拮抗作用的测定  42-48
  1 材料与方法  42-46
    1.1 供试菌株  42
    1.2 抗菌谱的测定  42
    1.3 JK-3 菌株对西瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用  42-43
    1.4 JK-3 菌株对西瓜枯萎病的盆栽防效试验  43-44
      1.4.1 西瓜苗的培育  43
      1.4.2 温室栽培防效试验  43-44
    2 结果与分析  44
    2.1 拮抗谱的测定  44-45
    2.2 对西瓜枯萎病菌孢子萌发的抑制作用  45
    2.3 对西瓜枯萎病的盆栽防效试验  45-46
  3 小结与讨论  46-48
第六章 JK-3 菌株抗菌蛋白粗提及其理化性质测定  48-56
  1 材料与方法  48-51
    1.1 试剂与仪器  48
    1.2 无菌滤液的制备  48
    1.3 硫酸铵盐析  48-49
    1.4 浓缩和脱盐  49
    1.5 抗菌蛋白稳定性测定  49-50
      1.5.1 热稳定性测定  49
      1.5.2 对紫外线稳定性测定  49
      1.5.3 对氯仿稳定性测定  49
      1.5.4 对蛋白酶K 稳定性测定  49-50
    1.6 抗菌蛋白组成测定  50-51
      1.6.1 油红-O 染色液显色反应  50
      1.6.2 蒽酮反应  50
      1.6.3 茚三酮反应  50
      1.6.4 硝酸反应  50
      1.6.5 双缩脲反应  50-51
  2 结果与分析  51-56
    2.1 抗菌蛋白的粗提  51-53
    2.2 抗菌蛋白稳定性的测定  53-54
      2.2.1 抗菌蛋白的热稳定性  53
      2.2.2 抗菌蛋白对紫外线的稳定性  53
      2.2.3 抗菌蛋白对氯仿的稳定性  53
      2.2.4 抗菌蛋白对蛋白酶K 的稳定性  53-54
    2.3 抗菌蛋白组分的测定  54-55
      2.3.1 脂类物质的测定  54
      2.3.2 糖类物质的测定  54
      2.3.3 α-氨基酸的测定  54
      2.3.4 芳香族氨基酸的测定  54-55
      2.3.5 肽键的测定  55
    3 小结与讨论  55-56
第七章 后续工作的设想和展望  56-58
  1 内生菌的定殖研究  56-57
  2 抗菌蛋白的进一步研究  57-58
参考文献  58-65
附录  65-67
致谢  67-68
攻读学位期间发表的学术论文目录  68

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中图分类: > 农业科学 > 植物保护 > 各种防治方法 > 生物防治
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