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HLB感染柑桔韧皮部内生细菌区系的研究

作　者: 王爱华
导　师: 王中康
学　校: 重庆大学
专　业: 生物学
关键词: 柑桔黄龙病内生细菌 16S rRNA 常规分离培养 RFLP 群落多样性
分类号: S436.66
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 53次
引　用: 1次
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内容摘要

柑橘是世界上产量最大的水果,巴西是世界上产柑橘最多的国家,其次是中国、美国、墨西哥和西班牙。柑桔黄龙病(Citrus huanglongbing,HLB)是由难人工培养的韧皮杆菌(Cndidatus Liberibacter asiaticus)引起的柑桔毁灭性病害。目前还没有获得该病原菌的纯培养。新近的分子鉴定结果表明黄龙病罹病组织内除存在韧皮杆菌外,还存在其它致病微生物:植原体或伴生微生物,并认为其可能是黄龙病植株症状表现复杂多样的内在原因。本研采用常规分离培养技术与分子鉴定以及基于16S rDNA基因的RFLP(Restriction Fragment Length Polymorphism)法,对柑桔黄龙病植株和健康植株的韧皮部内生菌区系进行比较分析,为研究柑橘植株韧皮部内生细菌与黄龙病菌之间的相互关系奠定基础。利用分离培养的方法,根据菌落形态以及菌体形态共分离到21株柑桔韧皮部内生细菌,对21株内生细菌进行形态和生理生化测定。经形态学鉴定和序列比对:菌株WJ01,WJ02,WJ03,WJ05,WJ08,WJ12,WJ13,WJ16,WJ17,WJ18,WJ21为芽孢杆菌属(Bacillus sp.),WJ04和WJ14为假单胞菌属(Pseudomonas sp.),WJ06为葡萄球菌属(Staphylococcus sp.),WJ10为考克氏菌(Kocuria sp.)。其中鉴定到种的部分菌株:WJ07:约氏不动杆菌(Acinetobacter johnsonii)、WJ09:粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、WJ11:乳杆菌属草乳杆菌(Lysinibacillus graminis)、WJ15:微球菌属栖息微球菌(Miccrococcus sedentarius)、WJ19:产左聚糖微杆菌(Microbacterium laevaniformans)、WJ20;极小短小杆菌(Curtobacterium pusillum)的特征。在健康柑橘植株韧皮部中Bacillus sp.、Pseudomonas sp.、Kocuria sp.为优势菌群。在HLB柑橘植株韧皮部中Microbacterium sp.、Bacillus sp.、Pseudomonas sp.和Kocuria sp.为优势菌。且病株与健株相比, WJ19(Microbacterium sp.)的丰富度增加最为明显。利用16S rDNA-RFLP的方法分析柑桔内生细菌多样性。首先采用的保守性引物分别扩增健康和罹病柑桔韧皮部总内生细菌16S rDNA中的高变区V5、V6、V7、V8及V9,得到的片段长度约为700bp。回收产物进行T-A克隆,健株与病株分别随机挑取了229,228个阳性克隆子,进行PCR检测。提取阳性克隆子的质粒。含有的目的片段的质粒分别用MspⅠ,RsaⅠ,HaeⅢ限制性内切酶进行酶切。鉴别分析各个阳性克隆的酶切图谱类型,对文库中的所有克隆进行分型,不同的类型即是不同的分类操作单位(Operational Taxonomic Unit,OTU)。将不同的OTUs进行测序。测序结果与GenBank中的序列进行同源性比较,结果显示:鉴定出10个属的细菌以及11个不可培养细菌,其中9个OTUs的序列与GenBank中的序列比对相似性≤97%,这些可能是还未经过序列测定过的新菌种。不同属的RFLP OUTs在健株(health plant,HP)与病株(infected plant,IP)的16S rDNA克隆文库中所占的比率不同,分析结果显示:Dyella sp.(HP 27.08%;IP 25%),Enterobacter sp. (HP 3.93%;IP 0%),Serratia marcescens (HP16.16%;IP 18.86%),Enterococcus sanguinicola(HP 3.06%;IP 3.95%),Achromobacter sp.(HP 1.75%;IP 1.32%),Bosea sp. (HP 1.31%;IP 0.44%),Lysinibacillus fusiformis(HP 0%;IP 0.88%),Candidatus Liberibacter asiaticus(HP 0%;IP 3.07%),Bacillus sp.(HP 1.31%;IP 1.31%),Pseudomonas sp(.HP 17.03%;IP 17.54%),Uncultured bacterium clone(HP 28.38%;IP 27.63%)。常规分离培养与16S rDNA-RFLP的分析方法得到的结果不一致,这说明每种方法都有一定的优势性和局限性;单一使用存在局限性,需要两种方法结合,能够更全面地分析柑桔韧皮部内生细菌的多样性。常规分离培养与16S rDNA-RFLP的序列分析研究结果表明:健康和罹病柑桔的韧皮部都存在丰富的内生细菌,且这些内生细菌优势菌的种群丰富度与种类存在一定差异。深入研究黄龙病侵染后韧皮部中存在的Microbacterium sp.等不同的细菌菌群与黄龙病菌的相互作用可望发现促生或抑制活性的伴生微生物,为黄龙病病原物的人工培养提供新方法

全文目录

中文摘要  3-5
英文摘要  5-11
1 绪论  11-20
  1.1 研究背景和意义  11-14
    1.1.1 研究的背景  11-13
    1.1.2 研究的意义  13-14
  1.2 植物内生细菌  14-18
    1.2.1 植物内生细菌的定义  14
    1.2.2 植物内生细菌的多样性和分布  14-15
    1.2.3 植物内生细菌的研究方法  15-16
    1.2.4 植物内生细菌的作用  16-17
    1.2.5 植物内生细菌的研究前景  17-18
  1.3 限制性片段长度多态性（RFLP）分析方法的介绍  18-19
  1.4 研究目的与技术路线  19-20
    1.4.1 研究目的  19
    1.4.2 研究内容与技术路线  19-20
2 柑桔内生细菌的分离培养及序列分析  20-34
  2.1 引言  20-21
  2.2 材料与仪器  21-22
    2.2.1 研究材料  21
    2.2.2 培养基与试剂的配制  21
    2.2.3 试验仪器  21-22
  2.3 实验方法与步骤  22-27
    2.3.1 柑桔样品的采集与处理  22
    2.3.2 柑桔内生菌的分离纯化  22
    2.3.3 柑桔内生菌的培养形状与生理生化测定  22
    2.3.4 内生菌DNA 的提取  22-23
    2.3.5 内生细菌的 16S rDNA 片段的扩增和测序  23-24
    2.3.6 PCR 产物的纯化  24-25
    2.3.7 电转化感受态细胞的制备  25
    2.3.8 PCR 产物的连接与转化  25-26
    2.3.9 阳性克隆筛选  26-27
    2.3.10 系统发育分析  27
  2.4 结果与分析  27-32
    2.4.1 柑桔不同部位中内生细菌的分离结果  27-28
    2.4.2 内生细菌不同种群在健康和感病植株中的分布情况  28-29
    2.4.3 内生细菌的 16S rRNA 的扩增  29
    2.4.4 阳性克隆的筛选  29-30
    2.4.5 内生细菌的生理生化测定及序列分析  30-31
    2.4.6 内生细菌的系统发育分析  31-32
  2.5 小结  32-34
3 PCR-RFLP 法分析柑桔内生细菌区系  34-48
  3.1 引言  34
  3.2 材料与仪器  34-35
    3.2.1 研究材料  34
    3.2.2 主要的试剂  34-35
    3.2.3 试验仪器  35
  3.3 实验方法与步骤  35-41
    3.3.1 柑桔内生细菌总DNA 的提取  35-36
    3.3.2 细菌 16S rRNA 基因 PCR 扩增  36-37
    3.3.3 PCR 产物的纯化  37
    3.3.4 高效感受态细胞的制备  37-38
    3.3.5 16S rRNA 基因文库的构建  38-39
    3.3.6 阳性克隆筛选  39-40
    3.3.7 阳性克隆质粒的提取  40-41
    3.3.8 RFLP 酶切分型和系统进化关系分析  41
  3.4 结果与分析  41-47
    3.4.1 柑桔内细菌的 16S rDNA 的扩增  41-42
    3.4.2 阳性克隆的鉴定  42
    3.4.3 限制性内切酶酶切分析结果  42-45
    3.4.4 系统发育分析  45-47
  3.5 本章小结  47-48
4 结论与展望  48-50
  4.1 主要结论  48-49
    4.1.1 柑桔韧皮部内存在丰富的内生细菌，但不同部位内生细菌的分布存在差异  48
    4.1.2 传统分离培养与 16S rDNA-RFLP 的鉴定结果不一致  48-49
    4.1.3 病健植株韧皮部内生细菌分布存在差异  49
  4.2 后续工作与展望  49-50
致谢  50-51
参考文献  51-56
附录  56-60
  A 作者在攻读学位期间发表的论文目录  56
  B 作者在攻读硕士学位期间参加的科研项目  56-57
  C 柑桔内生细菌的纯培养  57-58
  D 柑桔韧皮部内生细菌形态及生理生化鉴定结果  58-60

HLB感染柑桔韧皮部内生细菌区系的研究

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