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毒死蜱农药降解菌及其降解特性的研究

作　者: 任明
导　师: 赵蕾
学　校: 山东师范大学
专　业: 微生物学
关键词: 韭菜 内生细菌 毒死蜱 农药降解菌
分类号: X592
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


当前,韭菜地下害虫韭蛆的肆虐,迫使菜农在韭菜生产中大量使用化学杀虫剂。毒死蜱是常用的有机磷杀虫剂之一,虽然具有高效、低毒、广谱、低残留和低抗药性等优点,但大量使用造成了韭菜农药残留超标,严重危害了人类健康并造成了土壤生态环境的日益恶化。众所周知,微生物在降低作物及土壤农药残留中发挥了重要作用,许多农药降解微生物已得到开发应用。针对上述现状,本文从韭菜植株和韭菜根际土壤中分离并筛选具有毒死蜱降解能力的生防菌株,对于韭菜的无公害生产具有重要的现实意义和实践意义。具体结果如下:1.从新鲜韭菜的根中分离到一株对多种蔬菜病原真菌有抑制作用的优势内生细菌W7,其拮抗机制与已报道的其它生防细菌不同,其胞外代谢物对病原真菌无抑制作用,而菌体经超声波破碎及有机溶剂沉淀得到的菌体多糖粗提液可明显抑制病原菌菌丝生长。而且,该菌能以100mg/L高效氯氰菊酯为唯一碳源生长,7d的降解率为51.3%,但不能降解毒死蜱。通过对其形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,将其鉴定为类芽孢杆菌(Paenibacillus spp.)。2.从受农药污染的韭菜根际土壤中获得了一株高效毒死蜱降解细菌D10,该菌能以毒死蜱为唯一碳源生长,6d内对100mg/L的毒死蜱降解率达59.7%。通过形态特征、生理生化及16S rDNA同源性序列分析,鉴定该菌为不动杆菌(Acinetobacter.spp)。3.为进一步研究毒死蜱降解菌D10的降解特性,测定了外加碳源浓度、pH、温度、接种量及毒死蜱浓度对菌株降解率和生长量的影响。结果表明,当pH为8.0,温度为30～35℃,接种量在5%,毒死蜱浓度为200mg/L以下时,菌株D10的降解效果较好;在pH为8.0以上,外加碳源1%以上,温度为35℃,接种量10%,毒死蜱浓度为200mg/L以下时,菌株D10的生长量最大。4.采用超声波破碎、有机溶剂沉淀等方法从菌株D10中提取粗酶液,用于研究毒死蜱降解酶在细胞中的定位和性质。结果表明:毒死蜱降解酶主要位于胞内。该酶对毒死蜱的酶促降解最适pH为8.0,在碱性条件下相对稳定;最适温度为30℃,且具有较好的热稳定性。5.实验室模拟受污染土壤,研究菌株D10在土壤中的实际降解效果。结果表明,在添加了菌株D10的未灭菌土壤中,20d降解率达82.5%,而未灭菌土壤的自然降解率仅有26.7%,表明在土壤中添加菌株D10可明显降低土壤中的毒死蜱残留。6.由于韭菜优势内生细菌W7不能降解毒死蜱,为使其今后能通过转基因的方式获得毒死蜱降解能力,对菌株D10的毒死蜱降解酶基因进行初步研究。目前,已报道的有机磷降解酶基因位于质粒或者基因组DNA上。本研究对菌株D10多次进行质粒提取,电泳检测无质粒条带,从而可以判断菌株降解毒死蜱的相关基因位于基因组DNA上。根据已报道的甲基对硫磷降解酶(mpd)基因的编码区设计引物,PCR得到一条约900bp的片段。

全文目录


中文摘要  8-10
Abstract  10-12
第一章 文献综述  12-27
  1. 韭菜常见病虫害及常用杀虫剂  12-14
    1.1 韭菜常见病虫害  12
    1.2 韭菜常用杀虫剂  12-14
      1.2.1 毒死蜱简介  12-13
      1.2.2 毒死蜱的应用概况  13-14
      1.2.3 毒死蜱在应用中存在的问题  14
  2. 常用杀虫剂的残留问题  14-16
    2.1 韭菜农药残留严重的原因  14-15
    2.2 毒死蜱的残留问题  15-16
      2.2.1 毒死蜱在植物中的残留  15
      2.2.2 毒死蜱在土壤中的残留  15-16
  3. 毒死蜱微生物降解的研究进展  16-21
    3.1 毒死蜱的降解机制  16
    3.2 微生物对毒死蜱的降解  16-17
    3.3 毒死蜱降解菌的研究进展  17-18
      3.3.1 国外毒死蜱降解菌的研究进展  17
      3.3.2 国内毒死蜱降解菌的研究进展  17-18
    3.4 毒死蜱微生物降解的研究现状及发展方向  18-20
      3.4.1 毒死蜱微生物降解的研究现状  18
      3.4.2 毒死蜱微生物降解的发展方向  18-20
    3.5 内生菌在生物修复方面的研究进展  20-21
      3.5.1 植物内生降解菌的研究  20-21
      3.5.2 内生细菌原位修复的优势  21
  4. 有机磷农药降解基因的克隆  21-24
    4.1 opd  22
    4.2 opdA  22-23
    4.3 adpB  23
    4.4 mpd  23
    4.5 oph  23-24
    4.6 hocA  24
    4.7 ophc2  24
    4.8 opaA  24
  5. 本研究的立题依据、研究内容及技术路线  24-27
    5.1 立题依据  24-25
    5.2 研究内容  25-26
    5.3 技术路线  26-27
第二章 韭菜内生农药降解生防细菌的分离与鉴定  27-46
  1. 材料与方法  27-34
    1.1 实验材料  27-29
      1.1.1 菌株来源  27
      1.1.2 供试病原菌  27
      1.1.3 仪器设备  27-28
      1.1.4 培养基  28-29
      1.1.5 主要试剂  29
    1.2 实验方法  29-34
      1.2.1 韭菜内生细菌的分离与保藏  29
      1.2.2 农药降解菌的筛选  29-30
      1.2.3 内生细菌对高效氯氰菊酯的降解作用  30-31
      1.2.4 菌株W7 的生物防治作用  31
      1.2.5 菌株W7 抑菌机制研究  31-32
      1.2.6 菌落形态和生理生化鉴定  32
      1.2.7 菌种分子生物学鉴定  32-34
  2. 结果与分析  34-44
    2.1 韭菜内生农药降解细菌的分离  34-35
    2.2 菌株W7 对高效氯氰菊酯的降解作用  35-36
      2.2.1 高效氯氰菊酯标准曲线的制作  35
      2.2.2 紫外分光光度法检测高效氯氰菊酯的回收率  35-36
      2.2.3 菌株的生长曲线和高效氯氰菊酯降解曲线  36
    2.3 菌株W7 的生物防治作用  36-41
      2.3.1 菌株W7 对病原真菌的抑菌作用  36-39
      2.3.2 菌株W7 的抑菌机制研究  39-41
    2.4 菌种鉴定  41-44
      2.4.1 形态及生理生化特征  41-42
      2.4.2 菌株W7 的分子鉴定  42-44
  3. 讨论  44-46
    3.1 韭菜优势内生细菌的筛选  44
    3.2 菌株W7 对高效氯氰菊酯的降解作用  44-45
    3.3 韭菜内生细菌的生防机制  45
    3.4 创新点  45-46
第三章 毒死蜱高效降解菌的分离与鉴定  46-59
  1. 材料与方法  46-50
    1.1 实验材料  46-47
      1.1.1 菌株来源  46
      1.1.2 培养基  46-47
      1.1.3 主要仪器和试剂  47
    1.2 实验方法  47-50
      1.2.1 毒死蜱降解菌的分离与保藏  47-48
      1.2.2 液体培养基中毒死蜱的提取及测定  48-49
      1.2.3 菌株D10 的生长曲线和降解曲线的测定  49-50
      1.2.4 菌种鉴定  50
  2. 结果与分析  50-56
    2.1 土壤中毒死蜱降解细菌的筛选  50-51
    2.2 紫外分光光度法测定毒死蜱浓度  51-52
      2.2.1 标准曲线  51
      2.2.2 紫外分光光度法检测毒死蜱的回收率  51-52
    2.3 菌株D10 的生长曲线及毒死蜱降解曲线  52-53
    2.4 菌株D10 菌落形态和生理生化鉴定  53
      2.4.1 菌落形态  53
      2.4.2 生理生化特征  53
    2.5 菌株D10 的分子鉴定  53-56
      2.5.1 菌株D10 基因组DNA 的提取  53-54
      2.5.2 菌株D10 16S rDNA 序列的克隆  54
      2.5.3 16S rDNA 序列测定  54-56
  3. 讨论  56-59
    3.1 高效降解菌株的筛选意义和筛选依据  56-57
    3.2 紫外分光光度法的可靠性分析  57
    3.3 细菌鉴定  57-58
    3.4 创新点  58-59
第四章 毒死蜱降解菌的降解特性及其降解酶基因的克隆  59-77
  1. 材料与方法  59-65
    1.1 实验材料  59-60
      1.1.1 培养基  59
      1.1.2 主要仪器和试剂  59-60
    1.2 实验方法  60-65
      1.2.1 培养条件对D10 生长量和毒死蜱降解率的影响  60-61
      1.2.2 菌株D10 毒死蜱降解酶的研究  61-63
      1.2.3 毒死蜱降解菌对土壤中毒死蜱的降解[42]  63-64
      1.2.4 降解毒死蜱相关基因定位的初步研究  64-65
  2. 结果与分析  65-75
    2.1 培养条件对菌株D10 生长量和降解率的影响  65-69
      2.1.1 外加碳源对D10 生长量和降解率的影响  65-66
      2.1.2 温度对D10 生长量和降解率的影响  66-67
      2.1.3 初始pH 值对D10 生长量和降解率的影响  67
      2.1.4 初始接菌量对D10 生长量和降解率的影响  67-68
      2.1.5 底物浓度对D10 生长量和降解率的影响  68-69
    2.2 毒死蜱降解酶降解特性研究  69-73
      2.2.1 毒死蜱降解酶的定位  69-70
      2.2.2 温度对毒死蜱酶促降解的影响  70-71
      2.2.3 pH 对毒死蜱酶促降解的影响  71-72
      2.2.4 毒死蜱降解酶的热稳定性  72-73
      2.2.5 毒死蜱降解酶的pH 稳定性  73
    2.3 菌株D10 对土壤中毒死蜱的降解作用  73-74
    2.4 降解毒死蜱相关基因定位的初步研究  74-75
      2.4.1 菌株D10 的质粒提取  74
      2.4.2 mpd 基因的PCR 扩增  74-75
  3. 讨论  75-77
    3.1 环境影响因子对微生物降解的影响  75
    3.2 微生物对毒死蜱的代谢方式  75-76
    3.3 关于毒死蜱降解菌降解能力存在差异的讨论  76-77
第五章 结论  77-78
参考文献  78-88
致谢  88-89
攻读学位期间发表论文情况  89

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中图分类: > 环境科学、安全科学 > 环境污染及其防治 > 农用化学物质、有毒化学物质污染及其防治
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