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叶子花内生细菌的多样性分析及BS11的抑菌活性的研究

作　者: 任红梅
导　师: 刘振宇
学　校: 山东农业大学
专　业: 植物病理
关键词: 叶子花内生细菌拮抗菌杨树腐烂病菌伯克氏菌
分类号: S182
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

植物内生细菌是定殖在健康植物的各种组织和器官中,与植物之间形成互惠共存、相互制约的和谐联合关系的一类微生物,是植物病害生物防治上一类极具应用潜能的资源菌。近几年,人们探索了大蒜,甘草,红树等多种具有特殊药用价值或特殊生态环境的植物的内生细菌的多样性及防病抗病效果,叶子花作为一种有着优良的耐高温、抗旱和抗污染特性的园林观赏植物,其内生细菌的研究却鲜见报道。基于这点,我们对本实验进行了设计,通过分离叶子花内生细菌并其多样性进行了分析;以杨树腐烂病菌为指示菌利用平板对峙的方法筛选出具有良好抑菌活性的内生菌株BS11,对BS11菌株进行了系统的分类学鉴定;对该拮抗菌的抗病、促生等活性进行了研究。具体结果如下:1用传统的分离培养的方法对叶子花植物不同组织进行多次内生细菌的分离,并对叶子花内生细菌的分离方法进行了优化。叶子花内生细菌的分离采用改进后的分离方法,具体如下:1)选材:选择多年生较为健壮的艳红叶子花为材料。2)取材:在叶子花枝条的中间部位,用无菌刀切取茎段和叶片,用铁铲挖10cm深切取叶子花的根段,摘取成熟的叶子花的叶,无菌条件下带回实验室。3)表面消毒:将组织块用无菌水表面冲洗,晾干,用十分之一天平分别称取叶子花的根、茎、叶组织各1g,剪成小块,然后依次在75%乙醇中浸泡30s、1%的升汞中浸泡2min,最后用无菌水漂洗3次。2采用Shannon-Wiener多样性指数(H)、丰度(D)、均匀度(J)和CFU4个指标对分离结果进行叶子花内生细菌的多样性分析。结果显示:不同月份所测得的CFU值存在差异, 6月份和9月份叶子花内生细菌的菌落数相对较多,到9月份达到最大值为1.3333,而3月份和12月份菌落个数相对较少,分别只有0.8和0.5333。从其他三个指标H、D、J来看,叶子花内生细菌的多样性、丰度和均匀度在6月份和9月份同3月份和12月份相比均较高;叶子花根中的多样性指数(H)的值、丰度指数(D)值和CFU值均高于其他两个组织。3以杨树腐烂病菌为指示菌,用对峙培养的方法对分离到的11株叶子花内生细菌进行筛选。结果发现:BS11菌株对杨树腐烂病菌的抑制率达到了71%。用其他病原真菌以同样的方法对BS11菌株的广谱抑菌性进行了检测,发现该菌株对合欢枯萎病菌、杨树水泡溃疡病菌、栀子花炭疽病菌、桑炭疽病菌、苹果轮纹病菌等的生长也有很好的抑制效果。4对BS11菌株进行了系统的分类学的鉴定。结果表明:将16SrDNA测序结果同其他序列一起,用MEGA4.0软件的NJ法建树,发现BS11和Burkholderia anthina聚类在一起。BS11菌株在NA培养基上菌落呈浅黄色,表面光滑,中央突起,边缘整齐;在PDA培养基上菌落呈白色,边缘波状,中央平整;革兰氏染色阴性、杆状、无芽孢;生理生化中氧化酶延迟反应。BS11的这些特征符合Burkholderia的特证。5用不同浓度梯度的BS11菌株发酵液对叶子花进行促生性检测。结果显示:稀释10×的菌液处理过的叶子花根长同清水对照的差异达到显著水平;未经稀释的发酵液对叶子花生根有抑制作用;稀释50×的发酵液对叶子花的生根没有明显的影响。

全文目录

中文摘要  7-9
英文摘要  9-11
1 引言  11-25
  1.1 叶子花属植物的研究概况  11-14
    1.1.1 叶子花属植物的起源  11
    1.1.2 叶子花属植物的主要种类  11-12
      1.1.2.1 叶子花（B. spectabilis Willd）  12
      1.1.2.2 光叶子花(B. glabra Choisy)  12
      1.1.2.3 中国叶子花属植物的主要栽培种  12
    1.1.3 叶子花属植物的应用  12-14
      1.1.3.1 园林绿化  12-13
      1.1.3.2 植物源医药  13
      1.1.3.3 植物源农药  13-14
  1.2 植物内生细菌的研究概况  14-21
    1.2.1 植物内生细菌的概念  14
    1.2.2 植物内生细菌的普遍存在性和生物多样性  14-18
      1.2.2.1 植物内生细菌的普遍存在性  14-15
      1.2.2.2 植物内生细菌的生物多样性  15-18
        1.2.2.2.1 已经分离到的植物内生细菌的种类  15-17
        1.2.2.2.2 植物内生细菌的分类  17-18
    1.2.3 植物内生细菌的作用  18-21
  1.3 伯克氏菌属的研究现状  21-23
    1.3.1 伯克氏菌属的研究概况  21-22
    1.3.2 伯克氏菌的分类地位研究  22
    1.3.3 伯克氏菌的分离鉴定  22-23
    1.3.4 伯克氏菌作为生防菌的应用  23
  1.4 研究的目的意义  23-25
2 材料与方法  25-39
  2.1 材料  25-28
    2.1.1 供试植物材料  25
    2.1.2 供试病原真菌  25
    2.1.3 培养基  25-27
    2.1.4 细菌染色试剂  27-28
    2.1.5 拮抗菌16SrDNA 鉴定试剂  28
    2.1.6 试验用到的主要仪器  28
  2.2 方法  28-39
    2.2.1 叶子花内生细菌的分离  28-29
    2.2.2 叶子花内生细菌的多样性分析  29-30
      2.2.2.1 叶子花内生细菌的初步统计  29
      2.2.2.2 叶子花内生细菌的多样性分析方法  29-30
    2.2.3 叶子花内生拮抗细菌的筛选  30
    2.2.4 叶子花内生拮抗细菌的鉴定  30-36
      2.2.4.1 革兰氏和芽孢染色鉴定  30-31
      2.2.4.2 生理生化鉴定  31-33
      2.2.4.3 16SrDNA 鉴定  33-36
        2.2.4.3.1 细菌总DNA 提取  33-34
        2.2.4.3.2 16SrDNA 扩增  34-35
        2.2.4.3.3 琼脂糖凝胶电泳检测PCR 产物  35-36
        2.2.4.3.4 序列测定  36
    2.2.5 拮抗细菌的广谱抗菌性的检测方法  36
    2.2.6 拮抗菌的活性测定方法  36-37
      2.2.6.1 拮抗菌抗菌活性测定  36-37
      2.2.6.2 拮抗菌的发酵液制备  37
    2.2.7 拮抗菌BS11 的促生活性测定  37-39
      2.2.7.1 拮抗菌对叶子花插穗的促生性  37-38
        2.2.7.1.1 叶子花的扦插方法  37
        2.2.7.1.2 菌液制备  37
        2.2.7.1.3 拮抗菌对叶子花的促生试验方法  37-38
      2.2.7.3 数据分析方法  38-39
3 结果与分析  39-47
  3.1 叶子花内生细菌的分离和拮抗内生细菌的初筛  39-41
    3.1.2 叶子花内生细菌的多样性  39-41
      3.1.2.1 一年内不同月份的叶子花内生细菌的多样性  39-40
      3.1.2.2 叶子花不同组织的内生细菌的多样性  40-41
    3.1.3 叶子花拮抗内生细菌的初筛  41
  3.2 叶子花内生细菌的鉴定  41-45
    3.2.1 形态鉴定  41-42
    3.2.2 叶子花内生细菌的生理生化鉴定结果  42-43
    3.2.3 分子鉴定  43-45
  3.3 叶子花内生拮抗细菌的活性  45-46
    3.3.1 叶子花内生拮抗细菌的广谱抗菌性  45-46
  3.4 叶子花内生拮抗细菌BS11 菌株的促生作用  46-47
    3.4.1 BS11 菌株发酵液对叶子花扦插生根的促生效果  46-47
4 讨论  47-48
5 结论  48-49
参考文献  49-56
致谢  56-57
附件  57

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