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转基因水稻TT51-1质粒分子纯化技术及准确测量方法研究

作　者: 臧超
导　师: 王晶
学　校: 中国计量科学研究院
专　业: 测试计量技术与仪器
关键词: 转基因水稻TT51-1 质粒分子纯化液相色谱超声波同位素稀释质谱数字PCR
分类号: S511
类　型: 硕士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

转基因作物核酸的定量检测缺乏精确的方法和需要满足计量要求的标准物质。质粒分子作为理想的标准物质候选物,其分离纯化制备、定性定量分析等关键研制技术已成为转基因检测标准物质研制的突破方向。本工作以转基因水稻TT51-1定量检测用的质粒分子(pTT51-1)为对象,研究了的精纯技术,并采用新建立的同位素稀释质谱与数字PCR技术对其进行了精确定量,为TT51-1质粒分子标准物质的研制提供了有效的方法。研究采用三步纯化的方法,通过柱吸附碱裂解的纯化系统,得到去除菌体蛋白、基因组、内毒素及有机溶剂等的质粒分子；通过串联液相体积排阻色谱、嗜硫色谱与阴离子交换色谱,得到了除RNA、开环质粒及浓缩的超螺旋质粒分子；通过透析降低了无机盐的离子强度,得到了满足仪器分析要求精度纯化质粒DNA分子。经过三步纯化的质粒分子满足了标准物质候选物的选材要求。建立了同位素稀释质谱的方法,采用聚焦超声以及酶解等预处理样品,通过优化超声破碎条件、酶解条件、色谱质谱等条件,实现了对pTT51-1质粒分子质量浓度的测量,以不同单核苷酸为内标的质量浓度平均测定结果为109.6μg/g,测定范围为(99.6-117.8)μg/g。采用数字PCR技术验证了pTT51-1质粒分子的IDMS测定结果。通过优化数字PCR的扩增反应参数与反应体系,实现了pTT51-1质粒分子拷贝数浓度的测量,测定结果为3.57×1010copies/μL,换算为质量浓度125.6±17.8μg/mL最后对比了IDMS与dPCR方法对相同pTT51-1质粒的测量,其结果具有一致性。满足为pTT51-1质粒分子标准物质量值测量的要求,为转基因水稻TT51-1质粒标准物质的验证提供了方法支持。

全文目录

致谢  5-6
摘要  6-7
Abstract  7-13
第一章绪论  13-28
  1.1 前言  13
  1.2 转基因水稻TT51-1的研究意义  13-15
    1.2.1 转基因水稻的研究现状  13-14
    1.2.2 转基因水稻TT51-1及研究重点难点  14-15
  1.3 转基因质粒分子简介  15-17
    1.3.1 质粒分子及其标准物质  15-16
    1.3.2 转基因质粒分子的制备  16-17
  1.4 转基因质粒分子纯化技术研究进展  17-20
    1.4.1 转基因质粒分子纯化的意义  17-19
    1.4.2 转基因质粒分子纯化技术  19-20
  1.5 转基因质粒分子测量技术的研究进展  20-26
    1.5.1 转基因质粒分子测量的研究意义  20-21
    1.5.2 转基因质粒分子的质量浓度测量技术  21-24
    1.5.3 转基因质粒分子的拷贝数浓度测量技术  24-26
  1.6 研究目标及主要研究内容  26-28
    1.6.1 问题现状与研究目标  26-27
    1.6.2 主要研究内容  27-28
第二章转基因水稻TT51-1质粒分子纯化技术研究  28-41
  2.1 前言  28
  2.2 转基因水稻TT51-1质粒分子的构建  28-30
    2.2.1 材料、实际及仪器  28
    2.2.2 实验方法  28-29
    2.2.3 结果与讨论  29-30
  2.3 转基因水稻TT51-1质粒分子的初步纯化  30-34
    2.3.1 材料、试剂及仪器  31
    2.3.2 实验方法  31-32
    2.3.3 结果与讨论  32-34
  2.4 转基因水稻TT51-1质粒分子的精度纯化  34-39
    2.4.1 材料、试剂及仪器  34-35
    2.4.2 实验方法  35
    2.4.3 结果与讨论  35-39
  2.5 转基因水稻TT51-1质粒分子中小分子与无机离子的去除  39-40
    2.5.1 材料、试剂及仪器  39
    2.5.2 实验方法  39
    2.5.3 结果与讨论  39-40
  2.6 本章小结  40-41
第三章转基因水稻TT51-1质粒分子液相色谱同位素稀释质谱测量方法研究  41-64
  3.1 前言  41-42
  3.2 材料、试剂及仪器  42
  3.3 实验方法  42-48
    3.3.1 超声法与酶解法对比处理TT51-1质粒  42-43
    3.3.2 破碎质粒的酶解  43-44
    3.3.3 高效液相色谱(HPLC)分离4种单核苷酸  44
    3.3.4 三重串联四级杆质谱测量4种单核苷酸条件的确立  44-45
    3.3.5 同位素稀释方法标准溶液的制备和样品的质粒处理  45-46
    3.3.6 同位素稀释质谱方法确认  46-47
    3.3.7 同位素稀释法测定样品TT51-1质粒的质量浓度  47-48
    3.3.8 不确定度评定  48
  3.4 结果与讨论  48-63
    3.4.1 TT51-1质粒分子的破碎方法选择及条件优化  48-50
    3.4.2 酶解条件优化  50-52
    3.4.3 高效液相色谱(HPLC)分离条件  52-53
    3.4.4 三重串联四级杆质谱测量4种单核苷酸条件的优化  53-58
    3.4.5 同位素稀释质谱方法确认结果  58-59
    3.4.6 TT51-1质粒样品质量浓度的测定结果  59-60
    3.4.7 测量不确定度的评定结果  60-63
  3.5 本章小结  63-64
第四章转基因水稻TI51-1质粒分子数字PCR测量方法研究  64-77
  4.1 前言  64-65
  4.2 材料、试剂及仪器  65
  4.3 实验方法  65-68
    4.3.1 数字PCR反应体系与反应参数  65
    4.3.2 数字PCR方法确认  65-66
    4.3.3 TT51-1质粒样品的梯度稀释  66
    4.3.4 数字PCR技术测定TT51-1质粒的浓度  66-67
    4.3.5 不确定度评定  67-68
    4.3.6 dPCR方法与IDMS方法测定pTT51-1样品结果的比较  68
  4.4 结果与讨论  68-75
    4.4.1 数字PCR反应优化结果  68-69
    4.4.2 数字PCR方法确认结果  69-70
    4.4.3 TT51-1质粒的数字PCR测量结果  70-71
    4.4.4 不确定度评定结果  71-74
    4.4.5 dPCR方法与IDMS方法测定结果的对比分析  74-75
  4.5 本章小结  75-77
第五章结论  77-78
附录  78-79
参考文献  79-82
发表论文情况  82

转基因水稻TT51-1质粒分子纯化技术及准确测量方法研究

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