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丁草胺对斑马鱼的内分泌干扰效应研究

作　者: 常菊花
导　师: 朱国念; 王鸣华
学　校: 南京农业大学
专　业: 农药学
关键词: 丁草胺斑马鱼毒性内分泌甲状腺轴性腺轴氧化损伤
分类号: S482.4
类　型: 博士论文
年　份: 2012年
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内容摘要

丁草胺属于酰胺类除草剂,它通过抑制杂草体内蛋白质合成而起到除草作用。斑马鱼具有产卵量多、前期胚胎透明、繁殖快、易于饲养等优点,成为继小鼠、果蝇、线虫之后又一新型模式生物。本论文采用鱼类活体(In vivo)实验方法,以丁草胺原药(我国应用最多的三个除草剂之一)为供试药剂,从下丘脑-垂体-甲状腺轴、下丘脑-垂体-性腺轴和氧化损伤等角度,研究丁草胺对斑马鱼内分泌干扰效应,并探讨其可能的作用机制。丁草胺对斑马鱼成鱼的急性毒性结果显示：丁草胺对斑马鱼成鱼96h的LC50值是0.49mg/L,根据农业部《农药安全评价准则》农药对鱼类毒性等级的划定标准,表明丁草胺对斑马鱼成鱼的毒性为高毒。采用GC—MS\MS对丁草胺原药中的杂质进行了鉴定,结果表明,96%丁草胺原药中主要杂质是二丁氧基甲烷和(2-氯-N-(2,6-二乙基苯基)乙酰胺。我们测定了斑马鱼整个生命周期中的甲状腺激素变化动态,结果表明斑马鱼的胚胎在28±1℃条件下,受精后48～72h内孵化,授精后0-3天胚胎孵化前T4和T3的含量没有显著变化；幼鱼体内T3含量在授精后第10天达到最高峰；幼鱼体内T4含量在授精后第21天达到最高峰。在斑马鱼生长后期,甲状腺激素会出现一个低平台期,本研究为将来选用斑马鱼进行污染物的内分泌干扰研究奠定了基础。从下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)调控角度出发,研究了丁草胺对斑马鱼幼鱼和成鱼体长、体重和生长因子等形态学指标的影响；运用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测丁草胺对斑马鱼成鱼血浆和幼鱼组织中甲状腺激素水平的影响；采用实时荧光定量PCR技术检测丁草胺对斑马鱼幼鱼甲状腺轴相关基因表达的影响。结果表明(1)丁草胺染毒30天后,25μg/L和100μg/L剂量可以导致斑马鱼幼鱼的生长因子(CF)增加,但是不同浓度丁草胺处理组中成鱼的生长因子与溶剂对照组相比,差异不显著；(2)丁草胺可以提高斑马鱼成鱼血浆中和幼鱼组织中甲状腺激素四碘甲状腺原氨酸(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)水平；(3)丁草胺可以使斑马鱼幼鱼促甲状腺激素释放激素(CRH)、促甲状腺激素(TSH)、转运蛋白(TTR)、甲状腺激素受体(TRα)、脱碘酶(Deio1)和纳/碘同向转运体(Slc5a5)等基因的表达量上调,葡萄糖醛酸转移酶基因(UGT1ab)基因的表达量下调,甲状腺过氧化物酶(TPO)、甲状腺球蛋白(TG)、脱碘酶(Deio2)和甲状腺激素受体(TRβ)的表达量没有变化。结果显示丁草胺对斑马鱼成鱼和幼鱼都具有一定的甲状腺干扰作用。从下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)调控角度出发,研究丁草胺对斑马鱼成鱼产卵及后代的影响；运用酶联免疫吸附分析(ELISA)检测丁草胺对斑马鱼成鱼血浆中性激素睾酮、雌二醇和卵黄蛋白原水平；采用实时荧光定量PCR技术检测丁草胺对斑马鱼幼鱼性腺轴的相关基因表达的影响,包括雌激素受体(ERα、ERβ1和ERβ2)、卵黄蛋白原(VTGI和VTG II)和芳香化酶(CYP19)等基因。结果显示丁草胺对斑马鱼的性腺轴具有一定的干扰作用,主要表现在(1)丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼的产卵次数和产卵量；(2)丁草胺可以降低雄鱼的性腺指数(GSI),但是对成鱼的肝腺指数(LSI)没有影响；(3)丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼血浆中的睾酮(T)和雌二醇(E2)水平,提高成鱼血浆中卵黄蛋白原(VTG)水平；(4)丁草胺可以使斑马鱼幼鱼卵黄蛋白原VTG II表达量上调,但是对幼鱼雌激素受体(ERα、ERβ1和ERβ2)和芳香化酶CYP19a的表达量没有影响。以雌性成鱼为受试对象,研究丁草胺对斑马鱼肝脏抗氧化防御系统的影响。肝脏是主要的生物富集器官,故被大量地用于外源物质毒理研究。结果显示丁草胺对斑马鱼具有氧化损伤作用。主要表现在丁草胺可以降低斑马鱼雌鱼肝脏中超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽转移酶(GST)的酶活性以及谷胱甘肽(GSH)含量,对肝脏过氧化氢酶(CAT)活性没有影响。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-12
术语和縮略语表  12-14
第一章文献综述  14-40
  1 硬骨鱼的内分泌系统  14-19
    1.1 下丘脑—垂体—甲状腺轴(HPT)  14-16
    1.2 下丘脑—垂体—性腺轴(HPG)  16-19
    1.3 下丘脑—垂体—肾上腺轴(HPA)  19
  2 环境内分泌干扰物简介  19-24
    2.1 内分泌干扰物的定义  19-20
    2.2 内分泌干扰物的危害  20-21
    2.3 内分泌干扰物的作用机理  21-22
    2.4 内分泌干扰物的检测方法  22-24
  3 鱼类在内分泌毒理学领域中的应用  24-28
  4 斑马鱼的毒理学研究进展  28-34
    4.1 斑马鱼的生物学特性  28-29
    4.2 斑马鱼在毒理学领域中的应用  29-34
      4.2.1 胚胎发育毒性和致畸效应研究  30-32
      4.2.2 神经系统发育毒性研究  32
      4.2.3 心血管发育毒性研究  32-33
      4.2.4 内分泌干扰效应研究  33-34
  5 酰胺类除草剂的毒理学研究进展  34-37
    5.1 酰胺类除草剂的毒理学研究  34-35
    5.2 丁草胺的使用现状  35-37
    5.3 丁草胺的毒理学研究  37
  6 论文研究目的、内容及意义  37-40
    6.1 研究的目的和意义  37-39
    6.2 研究内容  39-40
第二章丁草胺对斑马鱼的急性毒性及其原药中杂质的鉴定  40-46
  摘要  40-41
  1 材料与方法  41-42
    1.1 供试药剂  41
    1.2 主要仪器及设备  41
    1.3 试验用鱼  41
    1.4 成鱼急性毒性试验  41-42
    1.5 丁草胺原药中主要杂质的鉴定  42
    1.6 数据分析  42
  2 结果与分析  42-45
    2.1 丁草胺对斑马鱼成鱼的急性毒性  42-43
    2.2 丁草胺原药中主要杂质GC-MS/MS分析  43-45
  3 讨论  45-46
第三章丁草胺对斑马鱼生长和下丘脑-垂体-甲状腺轴的影响  46-67
  摘要  46-47
  1 材料和方法  47-51
    1.1 供试药剂和主要试剂  47
    1.2 主要仪器及设备  47-48
    1.3 试验用鱼和胚胎收集  48
    1.4 斑马鱼整个生命周期中甲状腺激素的变化动态  48
    1.5 丁草胺对斑马鱼胚胎染毒  48-49
    1.6 丁草胺对斑马鱼成鱼染毒  49
    1.7 毒理学终点的测定  49-51
      1.7.1 斑马鱼的体长和体重的测定  49
      1.7.2 斑马鱼体内甲状腺激素水平的测定  49
      1.7.3 甲状腺轴相关基因表达量的测定  49-51
    1.8 数据分析  51
  2 结果与分析  51-61
    2.1 甲状腺激素在斑马鱼整个生命周期中的变化动态  52-54
    2.2 丁草胺对斑马鱼生长发育的影响  54-56
      2.2.1 丁草胺对斑马鱼幼鱼体长和体重的影响  54-55
      2.2.2 丁草胺对斑马鱼成鱼体长和体重的影响  55-56
    2.3 丁草胺对斑马鱼甲状腺激素水平的影响  56-58
      2.3.1 丁草胺对斑马鱼幼鱼甲状腺激素水平的影响  56-57
      2.3.2 丁草胺对斑马鱼成鱼甲状腺激素水平的影响  57-58
    2.4 丁草胺对斑马鱼甲状腺轴相关基因表达量的影响  58-61
  3 讨论和小结  61-67
    3.1 讨论  61-65
    3.2 小结  65-67
第四章丁草胺对斑马鱼生殖和下丘脑-垂体-性腺轴的影响  67-80
  摘要  67-68
  1 材料与方法  68-71
    1.1 供试药剂和主要试剂  68
    1.2 主要仪器及设备  68
    1.3 试验用鱼和胚胎收集  68-69
    1.4 胚胎染毒  69
    1.5 成鱼染毒  69
    1.6 毒理学终点的测定  69-70
      1.6.1 F0代成鱼产卵的调查  69
      1.6.2 F0代成鱼性腺指数和肝腺指数的测定  69
      1.6.3 F0代成鱼性激素水平的测定  69
      1.6.4 F1代存活率的调查  69-70
      1.6.5 性腺轴相关基因表达量的测定  70
    1.7 数据分析  70-71
  2 结果与分析  71-77
    2.1 丁草胺对斑马鱼成鱼产卵的影响  71-72
    2.2 丁草胺对斑马鱼成鱼性腺指数和肝腺指数的影响  72-73
    2.3 丁草胺对斑马鱼成鱼性激素和卵黄蛋白原水平的影响  73-74
    2.4 丁草胺对F1代的致死效应  74-75
    2.5 丁草胺对斑马鱼性腺轴相关基因表达量的影响  75-77
  3 讨论和小结  77-80
    3.1 讨论  77-79
    3.2 小结  79-80
第五章丁草胺对斑马鱼抗氧化酶系统的影响  80-88
  摘要  80-81
  1 材料与方法  81-82
    1.1 供试药剂和主要试剂  81
    1.2 主要仪器及设备  81
    1.3 试验用鱼和暴露条件  81
    1.4 生化指标的测定  81-82
    1.5 数据分析  82
  2 结果与分析  82-84
  3 讨论  84-88
全文总结  88-90
论文创新点  90-91
不足与展望  91-92
参考文献  92-110
附录  110-124
致谢  124-126
攻读学位期间发表的学术论文  126

丁草胺对斑马鱼的内分泌干扰效应研究

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