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耐热中性脂肪酶产生菌Pseudomonas sp.ZBC1的筛选及发酵条件的优化

作　者: 程兴
导　师: 张部昌
学　校: 安徽大学
专　业: 微生物
关键词: 假单胞菌属脂肪酶耐热的响应面方法
分类号: TQ925
类　型: 硕士论文
年　份: 2013年
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内容摘要

脂肪酶(三酰基甘油酰基水解酶E.C.3.1.1.3)能催化水解三酰基甘油类生成甘油二酯、甘油单酯、甘油和游离的脂肪酸,而在非水解介质中,能催化酯类的逆向合成反应。由于微生物脂肪酶具有较高的稳定性、选择性和底物特异性,所以被广泛应用于各种生物技术领域。目前,脂肪酶除了被广泛应用于洗涤、造纸和化妆品合成工业,在食品工业上也有大量的应用,特别是利用脂肪酶作为生物催化剂,催化酯交换反应。通过酶法酯交换可以改善油脂的物理性质,得到人们需求的新型油脂。酯交换可以代替部分氢化作用不生成反式脂肪酸。已有大量文献报道,反式脂肪酸的食入会促进冠心病、糖尿病及癌症的发生。在自然界中脂肪酶普遍存在,但只有微生物脂肪酶具有比较重要的商业价值。目前,已报道的工业脂肪酶主要来自于酵母菌、真菌和细菌。假单胞菌脂肪酶具有独特的性质满足工业应用,特别是食品工业。但是,由于假单胞菌脂肪酶的价格高,产量低,所以提高脂肪酶产量是应用于工业的关键。统计设计试验是对试验进行指导和设计,从而利用最少的试验获得最多的信息。本文以脂肪酶为研究对象,开展脂肪酶生产菌株的筛选、鉴定、酶学性质的研究及发酵条件优化,为进一步工业化应用奠定基础。对40株分离于富油土壤的微生物进行产脂肪酶筛选,发现16株是脂肪酶生产菌株。利用橄榄油Rhodamine B平板和液态摇瓶发酵的方法,筛选出3株活力较高的菌株ZBC1、ZBC2和ZBC3进行下一步研究。经16S rRNA序列分析,结合菌株形态和生化特征,初步鉴定这3个菌株分别为Pseudomonas sp. ZBC1、Burkholderia sp. ZBC2和Klebsiella sp. ZBC3。通过液态摇瓶发酵研究,Pseudomonas sp. ZBC1在发酵48h后达到最大酶活力8.5U/mL; Burkholderia sp. ZBC2在发酵120h后达到最大酶活力8.25U/mL; Klebsiella sp. ZBC3在发酵72h后达到最大酶活力8.25U/mL。选择Pseudomonas sp. ZBC1为出发菌株,进行下一步的酶学性质研究和发酵条件的优化。对Pseudomonas sp. ZBC1脂肪酶的酶学性质进行研究：脂肪酶的最适作用温度为80℃,并且在这个温度下具有较好的稳定性；最适作用pH值为7.0,并且在pH值为6.5-9.0之间具有较好的稳定性。通过单因素单因子试验优化Pseudomonas sp. ZBC1的发酵条件。研究表明：菌株发酵的最佳碳源为麦芽糖,次之为蔗糖、淀粉、甘油和酵母提取物,葡萄糖对菌株产酶具有抑制作用；无机氮源(NH4NO3)和有机氮源(黄豆粉)作为菌株发酵的最佳氮源；菌株发酵培养基最适初始pH值为6；250mL的三角锥型瓶,最适装瓶量为50mL；当菌种种龄为16h,接种量为15%时,菌株的产酶量达到最大值；添加0.7mg/mLMgSO4和0.5mg/mL Na2HPO4时,更有利于酶的产生。由于单因素单因子法不能考察因素间的交互作用,从而不能精确获得最佳的优化配方。为了弥补单因素单因子实验的缺陷,本研究将单因素单因子法和统计设计方法结合起来优化Pseudomonas sp. ZBC1产脂肪酶的发酵条件。Plackett-Burman (PB)设计从10个对酶产量有影响的因子(黄豆粉、NH4NO3、 Na2HPO4、pH、接种量、装瓶量、蔗糖、橄榄油和麦芽糖)中筛选出3个显著性影响因子分别为：MgSO4、接种量和装瓶量。通过响应面方法来优化发酵条件,当MgSO4,接种量和装瓶量分别为0.85g/L、6.59%和51.57mL时,为菌株发酵的最佳条件。通过培养基优化后,酶的产量提高了2.3倍(从8.5U/mL提高到19.5U/mL)。

全文目录

摘要  3-5
ABSTRACT  5-7
目录  7-10
缩略词表  10-11
第1章前言  11-22
  1.1 脂肪酶的分子结构和催化特性  11-13
  1.2 微生物脂肪酶的来源  13-15
    1.2.1 丝状真菌  13-14
    1.2.2 酵母菌  14
    1.2.3 细菌  14-15
  1.3 微生物脂肪酶的发酵生产  15-16
    1.3.1 影响脂肪酶发酵产量的因素  15-16
    1.3.2 发酵产酶条件的优化  16
  1.4 微生物脂肪酶活力的测定  16-18
    1.4.1 平板测定法  17
    1.4.2 碱滴定法  17-18
    1.4.3 比色法  18
  1.5 脂肪酶在工业上的应用  18-20
    1.5.1 脂肪酶在洗涤工业中的应用  18-19
    1.5.2 脂肪酶在食品工业中的应用  19
    1.5.3 脂肪酶造纸工业中的应用  19-20
    1.5.4 脂肪酶在酯类合成中的应用  20
    1.5.5 其它应用  20
  结束语  20-22
第2章材料与方法  22-39
  2.1 材料  22-26
    2.1.1 质粒  22
    2.1.2 菌种  22
    2.1.3 土样  22
    2.1.4 培养基  22-23
    2.1.5 DNA标记物、工具酶  23
    2.1.6 缓冲液和有机混合液  23-25
    2.1.7 试剂盒、试剂  25
    2.1.8 仪器设备  25-26
  2.2 实验方法  26-39
    2.2.1 产脂肪酶菌株的筛选  26-28
      2.2.1.1 富集培养  26
      2.2.1.2 初筛(定性筛选)  26
      2.2.1.3 复筛(定量筛选)  26-27
      2.2.1.4 脂肪酶活力测定  27-28
    2.2.2 菌株的形态,生理生化鉴定  28-29
    2.2.3 菌株的16S rRNA菌株鉴定  29-33
    2.2.4 酶学性质的研究  33-34
      2.2.4.1 酶作用的最适温度和热稳定性  34
      2.2.4.2 酶作用的最适pH和稳定性  34
    2.2.5 发酵条件的优化  34-39
      2.2.5.1 最佳碳源  34-35
      2.2.5.2 最佳氮源  35
      2.2.5.3 最佳发酵时间  35
      2.2.5.4 最适初始发酵pH  35
      2.2.5.5 不同装瓶量对产酶量的影响  35-36
      2.2.5.6 不同接种量对产酶量的影响  36
      2.2.5.7 种龄对产酶量的影响  36
      2.2.5.8 磷酸盐对产酶的影响  36
      2.2.5.9 不同镁离子浓度对产酶量的影响  36-37
      2.2.5.10 Plaekett-Burman实验设计  37
      2.2.5.11 响应面分析法  37-38
      2.2.5.12 优化培养基验证  38-39
第3章脂肪酶高产菌株的筛选和鉴定  39-50
  3.1 引言  39
  3.2 结果和讨论  39-49
    3.2.1 初筛的结果  39-40
    3.2.2 复筛的结果  40-44
    3.2.3 菌株的形态,生理生化鉴定  44
    3.2.4 基因组的提取  44-45
    3.2.5 16S rRNA序列的PCR扩增  45-46
    3.2.6 重组质粒的鉴定  46-47
    3.2.7 16S rRNA序列分析及系统树的构建  47-49
  3.3 小结  49-50
第4章酶学性质的研究与发酵条件的优化  50-64
  4.1 引言  50
  4.2 结果和讨论  50-63
    4.2.1 酶学性质的研究  50-53
      4.2.1.1 酶作用的最适温度和热稳定性  50-52
      4.2.1.2 酶作用的最适pH和稳定性  52-53
    4.2.2 发酵条件的优化  53-63
      4.2.2.1 最佳碳源  53-54
      4.2.2.2 最佳氮源  54-55
      4.2.2.3 最适初始发酵pH  55-56
      4.2.2.4 不同装瓶量对产酶量的影响  56
      4.2.2.5 不同接种量对产酶量的影响  56-57
      4.2.2.6 种龄对产酶量的影响  57-58
      4.2.2.7 磷酸盐对产酶的影响  58
      4.2.2.8 不同镁离子浓度对产酶量的影响  58-59
      4.2.2.9 Packett-Burman试验  59-60
      4.2.2.10 响应面试验  60-63
  4.3 小结  63-64
第5章总结  64-66
  5.1 获得的主要结果  64
  5.2 创新之处  64-65
  5.3 下一步研究内容  65-66
参考文献  66-70
附录  70-74
致谢  74

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