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胸腺五肽及其酯化物贮库型注射剂的研究

作　者: 迟强
导　师: 梅兴国
学　校: 中国人民解放军军事医学科学院
专　业: 药剂学
关键词: 胸腺五肽成酯修饰衍生物贮库型注射剂
分类号: R94
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

随着生物技术的发展,蛋白多肽药物在现代疾病的预防和治疗中的应用日益广泛。蛋白多肽类药物稳定性差,口服或其它非注射给药途径生物利用度低,目前大部分蛋白多肽类药物采用注射给药;另一方面,由于该类药物在血液中的半衰期很短,注射后很快被清除或降解,因此需要频繁给药,患者顺应性较差。将蛋白多肽类药物制备成缓释注射剂不仅可以减少给药次数,提高患者依从性和治疗效果,同时还可以降低药物的毒副作用,减少总给药剂量,从而减轻病人的经济负担。胸腺五肽是一种临床上广泛应用的双向免疫调节剂,能够选择性诱导和促进T细胞的分化、增殖和成熟,调节T细胞亚群的比例,使CD4~+/CD8~+趋于正常。目前上市的胸腺五肽制剂以冻干粉针剂为主。但有研究证实,胸腺五肽的效能可以通过缓慢输注得到增强,因此开发能够持续释放药物的缓释制剂对于药物效能的发挥也是有利的。制备缓释制剂主要依据两个原理,一是减少溶出(Noyes-Whitney方程),一是减少扩散(Fick第一扩散定律)。根据Noyes-Whitney方程,减少药物的溶出则可以使溶出速度减慢;而降低药物的溶解度,主要基于两种途径,一种是制成不溶性盐和不溶性复合物,另一种是对药物进行结构修饰。本课题两种途径并行,一方面尝试将胸腺五肽直接制成不溶性复合物,另一方面则对胸腺五肽进行了成酯修饰。制备不溶性盐(酯)和不溶性复合物,制备方法比较简单,产品易于实现工业化生产,是一种广泛应用于上市产品的方法。因此,只要可以制备适宜的水不溶性盐(酯)而且其药效确切,未来的药物制剂仍会利用这种相对简单的方法继续生产缓释药物产品。本文首先尝试制备了胸腺五肽与羧甲基纤维素钠的水不溶性复合物。由于胸腺五肽水溶性大,不溶性复合物的生成量较少,收率较低,同时这种不溶性复合物的释放受释放介质离子强度的影响较大,在模拟组织液(Hank’s平衡盐溶液)中释放时间短,仅约6h,不能达到实验目的。为降低胸腺五肽的水溶性和提高其药效,本文采用化学方法对其进行了成酯修饰,得到不同链长的胸腺五肽酯化物。对各种胸腺五肽酯化产物进行了初步药效学研究。结果表明,酯化物的药效比原药有所增强。进而对酯化物的安全性和稳定性进行了考察,从中选择胸腺五肽乙酯作为模型药物,进一步制备不溶性复合物,最终制备出胸腺五肽乙酯的鞣酸盐复合物。这种复合物的油混悬液在体内外均显示出长效缓释作用。1胸腺五肽酯化物的合成、纯化与鉴别本文采用二氯亚砜法以不同链长的脂肪醇与胸腺五肽进行反应,对胸腺五肽末端羧基和侧链羧基同时进行酯化,得到了胸腺五肽的乙酯、丁酯、己酯和十二醇酯。采用重结晶、制备型薄层色谱或中压反相层析等方法对胸腺五肽酯化物进行了分离纯化,采用HPLC-ESI-MS法,辅以核磁共振和紫外光谱法对酯化产物进行了结构确证。2胸腺五肽酯化物的理化性质及稳定性研究胸腺五肽酯化物的理化性质与原药相比,发生较大的改变,脂溶性增大,水溶性明显降低,并且以胸腺五肽乙酯进行的血浆稳定性考察结果显示,其血浆半衰期稍有延长。酯化物的稳定性影响因素研究结果显示,酯化物对光较为敏感,高温、高湿环境对酯化物的稳定性也有一定影响。因此,酯化物应在低温避光干燥处存放。3胸腺五肽酯化物的药效学研究以MTT法考察了胸腺五肽酯化物对小鼠脾淋巴细胞增殖的影响,结果表明,胸腺五肽酯化物能够促进小鼠脾淋巴细胞的增殖,其作用强于胸腺五肽;并且酯化物的活性随脂肪链的延长而增强。另外,在氢化可的松所致大鼠免疫抑制模型上,以血浆SOD酶活力为指标,考察了胸腺五肽乙酯对免疫抑制大鼠SOD酶活力的影响。结果,胸腺五肽乙酯能够明显增强氢化可的松所致免疫抑制大鼠的血浆SOD酶活力,作用也强于胸腺五肽。4胸腺五肽酯化物的初步安全性评价采用小鼠为受试动物,以静脉注射和皮下注射两种给药途径对胸腺五肽乙酯和己酯的急性毒性进行了初步考察。结果表明,酯化物的毒性较胸腺五肽明显增大,静脉给药途径尤其明显,且己酯的毒性大于乙酯。但毒性反应持续时间较短,除急性死亡者外,一般在20 min内都会恢复正常。存活的小鼠在两周的观察期内均没有出现死亡,体重比给药前有所增加。皮下注射给药时胸腺五肽乙酯剂量达170 mg/kg(比静脉大一倍时),仍未见明显毒性反应,因而认为胸腺五肽乙酯皮下注射给药较为安全。在综合考虑药效、毒性和制备工艺的难易程度的基础上,确定胸腺五肽乙酯用于下一步的制剂研究。5胸腺五肽乙酯鞣酸盐的制备与体内外评价胸腺五肽乙酯与鞣酸可以形成稳定的不溶性复合物,该复合物在Hank’s平衡盐溶液中维持了较长的释放时间。大鼠体内药效学实验结果显示,皮下给予胸腺五肽乙酯鞣酸盐油溶液后血浆SOD活力明显增高,并持续约一周,SOD水平与普通制剂有显著性差异。本课题的创新之处在于,将胸腺五肽进行成酯修饰,得到药效增强,脂溶性增加的酯化产物,这些酯化产物目前还未见报道。另外,本课题在制备缓释制剂过程中,将药剂学方法和化学方法相结合,在通过化学修饰方法来实现缓控释方面进行了有益的探索。

全文目录

缩略词表  8-9
中文摘要  9-12
英文摘要  12-17
第一章前言  17-32
  1.1 胸腺五肽的基础与临床研究概况  17-22
  1.2 胸腺五肽类似物的研究概况及发展趋势  22-25
    1.2.1 TP5 类似物的结构要求  22-23
    1.2.2 多肽化学修饰的常用方法  23-25
  1.3 制备胸腺五肽缓释制剂的依据  25-27
  1.4 本课题要解决的问题  27-28
  1.5 本课题在推进科学研究、军事医学发展方面的实用价值与理论意义  28
  1.6 论文指导思想和研究思路  28-29
  参考文献  29-32
第二章胸腺五肽-CMC 复合物的制备及其体外释放  32-43
  2.1 仪器与材料  32-33
    2.1.1 仪器  32-33
    2.1.2 材料  33
  2.2 TP5-CMC 复合物的制备方法  33-35
    2.2.1 TP5-CMC 复合物制备影响因素考察  33-34
    2.2.2 利用三相图考察复合物的制备条件  34-35
    2.2.3 样品制备  35
  2.3 TP5-CMC 复合物含量测定  35-37
    2.3.1 标准曲线的建立  35-36
    2.3.2 回收率试验  36-37
    2.3.3 样品含量测定  37
    2.3.4 粒径测定  37
  2.4 TP5-CMC 复合物的体外释放  37-39
    2.4.1 释放介质的选择  37-38
    2.4.2 释放方法与结果  38-39
  2.5 讨论  39-40
  本章小结  40
  参考文献  40-43
第三章胸腺五肽酯化物的合成、纯化与鉴别  43-59
  3.1 仪器与材料  43-44
    3.1.1 仪器  43-44
    3.1.2 材料  44
  3.2 胸腺五肽酯化物的合成与纯化  44-48
    3.2.1 反应原理  44
    3.2.2 工艺流程图  44
    3.2.3 胸腺五肽乙酯的制备  44-46
    3.2.4 丁酯的合成与纯化  46-47
    3.2.5 己酯的合成与纯化  47
    3.2.6 十二醇酯的合成与纯化  47-48
  3.3 胸腺五肽酯化物的鉴别  48-52
    3.3.1 TP5 质谱分析  48
    3.3.2 胸腺五肽乙酯  48-50
    3.3.3 胸腺五肽丁酯  50-51
    3.3.4 胸腺五肽己酯  51-52
    3.3.5 胸腺五肽十二醇酯  52
  3.4 讨论  52-55
  本章小结  55-56
  参考文献  56-59
第四章胸腺五肽酯化物的理化性质及稳定性初步考察  59-74
  4.1 仪器与材料  59
    4.1.1 仪器  59
    4.1.2 材料  59
  4.2 胸腺五肽酯化物的溶解性测定  59-60
  4.3 胸腺五肽酯化物含量测定方法的建立（HPLC 法）  60-61
    4.3.1 色谱条件  60-61
    4.3.2 标准曲线的建立  61
    4.3.3 精密度考察  61
    4.3.4 稳定性考察  61
  4.4 胸腺五肽酯化物的油水分配系数测定  61-63
    4.4.1 溶剂的预饱和  61-62
    4.4.2 平衡时间的确定  62
    4.4.3 分配系数的测定  62
    4.4.4 测定结果  62-63
  4.5 HPLC 法测定胸腺五肽酯化物在血浆中的稳定性  63-67
    4.5.1 药物溶液的配制  63
    4.5.2 血浆样品的处理  63-64
    4.5.3 HLPC 条件  64-65
    4.5.4 测定结果  65-67
  4.6 TP5 乙酯在血浆中的代谢产物测定  67-68
  4.7 胸腺五肽乙酯稳定性影响因素考察  68-70
    4.7.1 光照试验  68-69
    4.7.2 高湿试验  69
    4.7.3 高温试验  69-70
  4.8 讨论  70-72
  本章小结  72
  参考文献  72-74
第五章胸腺五肽酯化物的药效学研究  74-87
  5.1 仪器和材料  74-75
    5.1.1 仪器  74
    5.1.2 材料  74-75
  5.2 体外胸腺五肽酯化物的活性测定（MTT 法）  75-78
    5.2.1 丝裂原刀豆蛋白A 最适浓度初选  75-76
    5.2.2 甲臜溶解时间的影响  76
    5.2.3 MTT 法测定胸腺五肽酯化物体外活性  76-78
  5.3 体内药效学评价  78-82
    5.3.1 胸腺五肽酯化物对大鼠免疫抑制模型血浆SOD 活力的影响  78-80
    5.3.2 MTT 法测定小鼠皮下给予胸腺五肽及其酯化物后的淋巴细胞增殖活性  80-82
  5.4 讨论  82-84
  本章小结  84-85
  参考文献  85-87
第六章胸腺五肽酯化物的初步安全性评价  87-96
  6.1 材料  87
    6.1.1 材料与试剂  87
    6.1.2 实验动物  87
  6.2 方法  87-89
    6.2.1 受试药物的配制  87-88
    6.2.2 给药途径  88
    6.2.3 剂量和分组  88
    6.2.4 给药容积  88
    6.2.5 观察指标  88-89
    6.2.6 剖检  89
  6.3 结果  89-90
    6.3.1 静脉给药条件下胸腺五肽乙酯和胸腺五肽己酯的半数致死量测定  89
    6.3.2 小鼠中毒症状观察  89
    6.3.3 胸腺五肽乙酯静脉注射后存活小鼠体重变化  89-90
    6.3.4 皮下给药条件下胸腺五肽乙酯和己酯的毒性考察  90
    6.3.5 剖检  90
  6.4 讨论  90-94
  本章小结  94
  参考文献  94-96
第七章胸腺五肽乙酯缓释注射剂的制备及初步评价  96-106
  7.1 仪器与材料  96-97
    7.1.1 仪器  96
    7.1.2 材料  96-97
  7.2 胸腺五肽乙酯不溶性复合物的制备  97-98
    7.2.1 溶液的配制  97
    7.2.2 不溶性复合物的制备方法  97
    7.2.3 结果  97-98
  7.3 胸腺五肽乙酯鞣酸盐含量测定方法的建立  98-100
    7.3.1 色谱条件  98
    7.3.2 样品制备  98
    7.3.3 色谱分离图  98-99
    7.3.4 线性范围  99
    7.3.5 回收率试验  99
    7.3.6 精密度试验  99-100
    7.3.7 稳定性考察  100
    7.3.8 复合物含量测定  100
  7.4 胸腺五肽乙酯鞣酸盐在 HBSS 中的释放情况考察  100-101
    7.4.1 释放方法  100
    7.4.2 释放结果  100-101
  7.5 胸腺五肽乙酯鞣酸盐的大鼠血浆 SOD 酶活性测定  101-102
    7.5.1 供试品制备  101
    7.5.2 给药与测定  101
    7.5.3 测定结果  101-102
  7.6 讨论  102-104
  本章小结  104
  参考文献  104-106
结论与展望  106-108
  1 全文总结  106-107
  2 课题创新点  107
  3 课题展望  107-108
致谢  108-109
个人简历  109-110

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