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极端嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1胞外糖苷水解酶类的产酶分析及其相关基因的克隆与表达

作　者: 罗会颖
导　师: 范云六
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 极端酶嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 产酶分析糖苷水解酶基因克隆基因表达
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2008年
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内容摘要

极端微生物在生态系统中发挥着重要作用,为人类提供了丰富的微生物资源。随着越来越多的极端微生物被分离鉴定,极端酶被分离纯化和极端酶工程研究的进展,极端酶在生物催化和生物转化中的应用将会得到更进一步的拓展。本文对分离自江西“721”矿区铀矿废水的真菌MEY-1进行了初步鉴定。该菌具有极端嗜酸性,它的最适生长pH为2.5～3.0,在pH1.0下也能较好生长。经ITS序列比对并结合形态分析,MEY-1属于Bispora属。嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1能分泌产生多种重要的工业用酶,其中包括木聚糖酶、β-葡聚糖酶、β-甘露聚糖酶、CMCase、淀粉酶、果胶酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖苷酶等九种糖苷水解酶。是一株优良的工业用酶产生菌。初步建立了一种能诱导嗜酸真菌MEY-1同时产生上述九种酶的发酵方法。通过优化培养基中麸皮、玉米芯粉、魔芋粉及豆粕的组成比例,培养的pH和温度,建立了4种诱导不同酶产生的方法。方法1:麸皮、玉米芯粉、豆粕比例为2:5:2,pH 2.0,培养温度20℃,高产β-甘露聚糖酶、CMCase、淀粉酶、果胶酶。方法2:麸皮、玉米芯粉、豆粕比例为2:5:2,pH 2.0,培养温度30℃,高产β-葡聚糖酶。方法3:麸皮、玉米芯粉、豆粕比例为1:1:7,pH4.0,培养温度30℃高产α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶和β-葡萄糖苷酶。方法4:麸皮、玉米芯粉、豆粕比例为5:2:2,pH 4.0,培养温度30℃,高产木聚糖酶。本文通过糖苷水解酶基因序列分析,从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1分离克隆到7种9个糖苷水解酶的基因。分别是:木聚糖酶基因3个,β-甘露聚糖酶基因、α-淀粉酶基因、α-半乳糖苷酶基因、β-半乳糖苷酶基因、β-葡萄糖苷酶基因、α-L-鼠里糖苷酶基因各1个。通过BLAST比对和序列一致性分析,它们核苷酸和氨基酸序列的最高相似性分别为:木聚糖酶基因xyl11A, 85.3%和93.7%;木聚糖酶基因xyl11B, 61.4%和57.0%;木聚糖酶基因xyl10A, 49.8%和43.6%;β-甘露聚糖酶基因man5A, 45.4%和47.1%;α-淀粉酶基因amyA, 60.2%和62.0%;α-半乳糖苷酶基因agalA, 54.2%和49.7%;β-半乳糖苷酶基因bgalA,56.8%和55.5%;β-葡萄糖苷酶基因bglA,49.5%和34.8%;α-L-鼠里糖苷酶基因rhaA,55.0%和44.9%。并对其中的8个酶做了三维结构的模拟和催化位点的分析,结果表明,除xyl11A外,这些基因均具有较高的新颖性。将Bispora sp.MEY-1来源的β-甘露聚糖酶基因man5A,和3个木聚糖酶基因xyl11A, xyl11B, xyl10A在毕赤酵母中进行了表达。在摇床水平上β-甘露聚糖酶MAN5A的表达量为64 U/mL,木聚糖酶XYL11A,XYL11B和XYL10A的表达量分别为:83 U /mL,54 U /mL和101 U /mL。验证了基因的功能。对重组的β-甘露聚糖酶MAN5A和3个木聚糖酶进行了纯化和酶学性质分析。β-甘露聚糖酶MAN5A的最适pH为1.0～1.5,在pH1.0～5.5范围内酶活性均能维持在70%以上。这是目前报道的最适pH最低的β-甘露聚糖酶。三个木聚糖酶XYL11A,XYL11B和XYL10A的最适pH分别为2.4,2.6和3.0。均为极端嗜酸木聚糖酶。MAN5A的最适温度为65℃,木聚糖酶XYL11A,XYL11B和XYL10A的最适温度分别为60℃和65℃和80℃。他们都具有极好的抗胃蛋白酶和胰蛋白酶的能力,37℃条件下处理60min后的酶活力是处理前的85～150%。大部分金属离子不影响酶活力或对酶有激活作用。重组的β-甘露聚糖酶比活为3373U/mg,Km值为1.56mg/mL, Vmax为6587.6μmol/min·mg。三个重组木聚糖酶XYL11A,XYL11B和XYL10A的比活分别为8334U/mg,2049U/mg和5437U/mg。Km分别为19.907 mg/mL,29.96 mg/mL和1.005 mg/mL。Vmax为7308.5μmol/min·mg,1757.2μmol/min·mg和2709μmol/min·mg。结果表明该四个酶都是极端嗜酸酶,具有很高的比活性。综合酶学性质表明他们都具有很好的工业应用前景。

全文目录

摘要  6-8
Abstract  8-13
第一章绪论  13-38
  1.1 极端微生物的研究概况  13-20
  1.2 嗜酸菌及嗜酸酶的研究进展  20-23
    1.2.1 嗜酸菌的来源  20
    1.2.2 嗜酸菌的分类  20-21
    1.2.3 嗜酸酶及其应用  21
    1.2.4 嗜酸酶的基因克隆与表达  21-23
  1.3 糖苷水解酶  23-25
    1.3.1 糖苷水解酶家族  23
    1.3.2 糖苷水解酶的催化机制  23-24
    1.3.3 糖苷水解酶的命名  24-25
  1.4 α-淀粉酶的研究进展  25-27
    1.4.1 淀粉酶概述  25
    1.4.2 α-淀粉酶  25-27
  1.5 纤维素酶的研究进展  27-30
    1.5.1 纤维素的结构  27-28
    1.5.2 纤维素酶概述  28
    1.5.3 纤维素酶的来源  28
    1.5.4 纤维素酶的家族及结构  28-29
    1.5.5 纤维素酶的基因克隆与表达  29-30
    1.5.6 纤维素酶的应用  30
  1.6 半纤维素酶的研究进展  30-35
    1.6.1 木聚糖酶研究进展  30-33
    1.6.2 β-甘露聚糖酶研究进展  33-35
  1.7 真菌基因克隆策略  35-38
    1.7.1 已知基因相关信息的基因克隆  35
    1.7.2 未知基因编码产物的基因克隆  35-38
第二章分离菌株的初步鉴定与产酶分析  38-54
  2.1 实验材料  38-40
  2.2 实验方法  40-43
  2.3 结果与分析  43-53
  2.4 讨论  53-54
第三章嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 糖苷水解酶基因的克隆  54-88
  3.1 实验材料  54
  3.2 实验方法  54-61
  3.3 实验结果  61-70
  3.4 讨论  70-88
第四章嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 甘露聚糖酶基因 man5A 在毕赤酵母中的表达及性质分析  88-109
  4.1 实验材料  88-89
  4.2 实验方法  89-94
  4.3 结果与分析  94-106
    4.3.1 β-甘露聚糖酶 MAN5A cDNA 信号肽编码序列的去除及 MAN5A-STT 的获得  94-95
    4.3.2 β-甘露聚糖酶基因 man5A 和 man5A-stt 在毕赤酵母中的表达  95-98
    4.3.3 β-甘露聚糖酶 MAN5A 和 MAN5A-STT 的纯化  98
    4.3.4 β-甘露聚糖酶 MAN5A 和 MAN5A-STT 的性质分析  98-106
  4.4 讨论  106-109
第五章嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 来源的 3 个木聚糖酶基因 xyl11A、xyl11B、xyl10A 在毕赤酵母中的表达及性质分析  109-133
  5.1 实验材料  109
  5.2 实验方法  109-113
  5.3 结果与分析  113-129
    5.3.1 木聚糖酶序列分析及信号肽编码序列的去除  113-117
    5.3.2 木聚糖酶基因在毕赤酵母中的表达  117
    5.3.3 三个木聚糖酶的纯化  117-119
    5.3.4 表达产物的序列测定及脱糖基化  119-120
    5.3.5 三个木聚糖酶的性质分析  120-129
  5.4 讨论  129-133
第六章全文结论  133-135
参考文献  135-144
致谢  144-145
作者简历  145

极端嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1胞外糖苷水解酶类的产酶分析及其相关基因的克隆与表达

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