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来源于嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1三种糖苷水解酶的基因克隆、表达与性质研究

作　者: 杨君
导　师: 姚斌
学　校: 中国农业科学院
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶 木聚糖酶 多聚半乳糖醛酸酶 基因克隆与表达 性质研究
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1分离自江西金属矿废水,具有极端嗜酸性,最适生长的pH为2.5-3.0,可分泌产生多种重要的工业用酶,包括β-葡聚糖酶、木聚糖酶、果胶酶、β-甘露聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、淀粉酶、CMCase以及β-葡萄糖苷酶等九种糖苷水解酶,是一株优良的工业产酶菌。本文从嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1分离克隆到3个糖苷水解酶基因,即β-1,3-1,4-葡聚糖酶bgl7A、木聚糖酶xylD和多聚半乳糖醛酸酶pga1。对三个基因进行了序列分析,并进行了三维结构的预测。它们的氨基酸序列同已知序列一致性在50–68%之间,具有较高的新颖性。将这三个基因在毕赤酵母中进行表达,并对重组酶进行了纯化和性质测定。β-1,3-1,4-葡聚糖酶BGL7A与来源于Aspergillus terreus的假定第七家族内切葡聚糖酶EG-1氨基酸序列具有最高一致性(59.5%)。BGL7A的最适pH值有三个峰值分别是pH 1.5、3.5和5.0,其中pH 5.0为最高值,最适温度为60°C,在pH 1.0–8.0之间和60°C分别处理60 min酶的稳定性良好。以大麦葡聚糖为底物测得Km和Vmax分别是9.16 mg/ml和6,737μmol/min/mg。以大麦葡聚糖和地衣多糖为底物分析BGL7A的比活分别为4,040和2,740 U/mg,高于CMC-Na的比活395 U/mg,这一点不同于其他已报道的第七家族内切葡聚糖酶。木聚糖酶XYLD与来源于Talaromyces stipitatus的假定内切-1,6-β-D-葡聚糖酶氨基酸序列具有最高一致性(49.9%),与来源于Leptosphaeria maculans的假定木聚糖酶的序列一致性为38.8%,但经性质研究发现其只具有木聚糖酶活性,不具有葡聚糖酶活性,经分析确定其为第30家族的木聚糖酶。最适pH值为3.0,最适温度为60°C,pH 1.0–6.0之间和温度60°C下分别处理60 min稳定性良好。XYLD以山毛榉木聚糖、桦木木聚糖、4-O-甲基-D-葡糖醛酸木聚糖和燕麦木聚糖为底物的比活分别是2,463、2,144、2,020和1,429 U/mg。以山毛榉木聚糖为底物分析表观Km和Vmax分别是5.6 mg/ml和3,622μmol/min/mg。多聚半乳糖醛酸酶PGA1与来源于Colletotrichum lupini的内切多聚半乳糖醛酸酶氨基酸序列具有最高一致性(67.2%)。最适pH和最适温度分别为3.5和55°C。在pH 2.0–7.0之间和60°C下稳定性良好。PGA1以多聚半乳糖醛酸和果胶为底物的比活分别为1,520和725 U/mg。以多聚半乳糖醛酸为底物分析表观Km和Vmax分别为1.25 mg/ml和2,526μmol/min/mg。用10 U/mL的PGA1处理苹果汁,可使苹果汁的粘度降低7.7%,而透光率增加84%。结果表明,酸性条件下PGA1具有良好工业应用潜力。本实验中克隆到的三个酶都是嗜酸酶,在饲料、食品等领域有广阔的应用前景。

全文目录


摘要  6-7
Abstract  7-16
第一章 引言  16-23
  1.1 细胞壁降解酶  16-20
    1.1.1 细胞壁降解酶概述  16
    1.1.2 纤维素酶  16-17
    1.1.3 半纤维素  17-18
    1.1.4 果胶酶  18-19
    1.1.5 角质酶  19
    1.1.6 其他酶类  19-20
  1.2 嗜酸菌  20-22
    1.2.1 嗜酸菌的来源  20
    1.2.2 嗜酸菌的分类  20
    1.2.3 嗜酸菌的应用  20-21
    1.2.4 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 的研究现状  21-22
  本研究目的和意义  22-23
第二章 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 三种嗜酸糖苷水解酶的基因克隆  23-42
  2.1 实验材料  23
    2.1.1 菌株、质粒和引物  23
    2.1.2 引物合成和核酸序列测序  23
    2.1.3 工具酶、生化试剂和试剂盒  23
    2.1.4 主要仪器  23
    2.1.5 溶液  23
  2.2 实验方法  23-28
    2.2.1 Bispora sp. MEY-1 基因组 DNA 的提取  23-24
    2.2.2 第7 家族β–葡聚糖酶基因同源克隆简并引物的设计  24
    2.2.3 第7 家族β–葡聚糖酶基因部分序列的获得  24
    2.2.4 木聚糖酶XYLD 及多聚半乳糖醛酸酶PGA1 部分序列的获得  24-25
    2.2.5 三个糖苷水解酶基因完整序列的获得  25-26
    2.2.6 所获得完整序列的分析  26-27
    2.2.7 三种糖苷水解酶cDNA 的克隆  27-28
    2.2.8 三个糖苷水解酶cDNA 序列分析  28
    2.2.9 三个糖苷水解酶三级结构的预测  28
  2.3 实验结果  28-40
    2.3.1 三个糖苷水解酶部分基因序列的获得  28-29
    2.3.2 第 7 家族 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 bgl7A cDNA 的获得及序列分析  29-32
    2.3.3 木聚糖酶基因xylD cDNA 的获得及序列分析  32-36
    2.3.4 多聚半乳糖醛酸酶基因pga1 cDNA 的获得及序列分析  36-40
  2.4 讨论  40-42
第三章 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 bgl7A 在毕赤酵母中的表达及性质分析  42-54
  3.1 实验材料  42
    3.1.1 菌株和质粒  42
    3.1.2 引物合成  42
    3.1.3 试剂盒、工具酶和生化试剂  42
    3.1.4 主要仪器  42
    3.1.5 培养基配制  42
  3.2 实验方法  42-46
    3.2.1 重组表达载体 pPIC9-bgl7A 的构建  42-44
    3.2.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性的测定  44
    3.2.3 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 bgl7A 在毕赤酵母中的表达  44-45
    3.2.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶BGL7A 的酶学性质测定  45-46
  3.3 结果与分析  46-51
    3.3.1 β-1,3-1,4-葡聚糖酶基因 bgl7A 在毕赤酵母中的表达  46-47
    3.3.2 β-1,3-1,4-葡聚糖酶BGL7A 的纯化  47-48
    3.3.3 表达产物的序列测定及脱糖基化  48
    3.3.4 β-1,3-1,4-葡聚糖酶BGL7A 的性质分析  48-51
  3.4 讨论  51-54
第四章 嗜酸真菌Bispora sp. MEY-1木聚糖酶基因xylD在毕赤酵母中的表达及性质分析  54-63
  4.1 实验材料  54
  4.2 实验方法  54-57
    4.2.1 重组表达载体pPIC9-xylD 的构建  54-55
    4.2.2 木聚糖酶活性的测定  55
    4.2.3 木聚糖酶基因xylD 在毕赤酵母中的表达  55-56
    4.2.4 木聚糖酶XYLD 的酶学性质测定  56-57
  4.3 结果与分析  57-61
    4.3.1 木聚糖酶基因xylD 在毕赤酵母中的表达  57-58
    4.3.2 木聚糖酶XYLD 的纯化  58
    4.3.3 表达产物的序列测定及脱糖基化  58-59
    4.3.4 木聚糖酶XYLD 的性质分析  59-61
  4.4 讨论  61-63
第五章 嗜酸真菌 Bispora sp. MEY-1 多聚半乳糖醛酸酶基因 pga1 在毕赤酵母中的表达及性质分析  63-73
  5.1 实验材料  63
  5.2 实验方法  63-67
    5.2.1 重组表达载体pPIC9-pga1 的构建  63-64
    5.2.2 多聚半乳糖醛酸酶活性的测定  64
    5.2.3 多聚半乳糖醛酸酶基因pga1 在毕赤酵母中的表达  64-65
    5.2.4 多聚半乳糖醛酸酶PGA1 的酶学性质测定  65-66
    5.2.5 多聚半乳糖醛酸酶PGA1 在果汁澄清中的应用  66-67
  5.3 结果与分析  67-71
    5.3.1 多聚半乳糖醛酸酶基因pga1 在毕赤酵母中的表达  67
    5.3.2 多聚半乳糖醛酸酶PGA1 的纯化  67-68
    5.3.3 表达产物的序列测定及脱糖基化  68
    5.3.4 多聚半乳糖醛酸酶PGA1 的性质分析  68-71
    5.3.5 多聚半乳糖醛酸酶PGA1 在果汁澄清中的应用  71
  5.4 讨论  71-73
第六章 结论  73-74
参考文献  74-81
附录  81-86
致谢  86-87
作者简介  87

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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