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CRH & Urocortin与外周炎症性疾病相关性的研究

作　者: 武玉清
导　师: 李胜男
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: Urocortin 大鼠 肺组织 哮喘 气道炎症 肺血管通透性 伊文思兰 肥大细胞 活化脱颗粒 [Ca2+]i 地塞米松 CRH LDLR-/-小鼠 RT-PCR 免疫组化 ELISA 动脉粥样硬化 血脂 抗氧化 CRHR1 CRHR2 VCAM-1 NF-κB IL-6 单核/巨噬细胞 淋巴细胞
分类号: R96
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


第一部分Urocortin与支气管哮喘相关性的研究支气管哮喘是一种以气道多种炎症细胞浸润为主，涉及多种炎性因子的慢性呼吸道非特异性炎症性疾病，严重威胁人类的健康和生命。目前对于支气管哮喘的防治并不理想，因此进一步探讨哮喘的发病机制，寻找新的防治哮喘的药物作用靶点具有重要的现实意义。Urocortin（UCN）是一种40个氨基酸的cRH家族神经肽，通过cRHR1和2发挥多种生物学作用。中枢产生的UCN通过下丘脑／垂体／肾上腺轴（HPA）发挥间接的免疫抑制作用。可是在外周UCN可能通过活化肥大细胞、巨噬细胞等参与了许多炎症性疾病的发生发展。虽然UCN在外周多种组织表达并发挥促炎作用，但其在肺组织中的表达及其是否有促进哮喘气道炎症的作用未见报道。本研究旨在探讨UCN在肺组织中的表达情况以及UCN与哮喘气道炎症的相关性。第一章Urocortin在大鼠肺组织中的表达情况目的观察UCN在大鼠肺组织中的表达情况。方法通过RT-PCR检测UCN mRNA的表达；采用免疫组化和Western blotting技术观察UCN肽在大鼠肺组织的表达。结果UCN mRNA和肽均明显表达在大鼠肺组织；免疫组化显示UCN主要表达在支气管粘膜和肺泡上皮，肺血管平滑肌和内皮细胞也有明显的表达。结论大鼠肺组织表达UCN。第二章Urocortin在支气管哮喘大鼠肺组织中表达显著增多目的观察UCN在正常大鼠和支气管哮喘大鼠肺组织中表达的差异。方法通过肺组织HE染色和肺泡盥洗液炎症细胞计数评价支气管哮喘大鼠气道炎症。采用RT-PCR方法半定量检测UCN mRNA的表达；采用免疫组织化学和Western blotting技术观察两组大鼠肺组织UCN肽的表达差异。结果支气管哮喘模型大鼠肺组织形成显著的炎症病理改变，肺泡盥洗液中炎症细胞数量显著增多。与健康对照大鼠相比，支气管哮喘模型大鼠肺组织UCN mRNA和肽的表达均显著增高。结论UCN在支气管哮喘大鼠炎症气道中表达显著增多。第三章Urocortin对大鼠肺血管通透性的影响及机制目的肺血管通透性增高是支气管哮喘的重要病理特征之一。本实验旨在研究UCN对大鼠肺血管通透性的影响及机制。方法通过伊文思蓝分光光度法评价肺血管通透性的大小，并采用HE病理染色观察肺组织充血水肿的程度。结果雾化吸入10-7和10-6M UCN显著提高了大鼠肺血管的通透性，非选择性CRHR拮抗剂Astressin显著阻断了UCN的这一效应，肥大细胞膜稳定剂Cromolyn和组胺H1受体拮抗剂Azelastine也显著降低了UCN对肺血管通透性的影响。白三烯受体拮抗剂Montelukast对UCN引起的肺血管通透性的增高没有显著影响。病理学检查显示雾化吸入10-7和10-6M UCN导致肺组织明显的充血水肿，Astressin，Cromolyn和Azelastine均不同程度地减轻了这一病理改变。结论雾化吸入UCN通过CRHR增高了大鼠肺血管通透性，肥大细胞和组胺可能参与了UCN的这一效应。第四章Urocortin对大鼠肺肥大细胞浸润和活化脱颗粒的影响目的研究UCN对大鼠肺组织肥大细胞浸润和活化脱颗粒的影响。方法通过免疫组化方法检测肺组织肥大细胞特异性蛋白酶Tryptase的表达以评价肥大细胞在肺组织的浸润数量；采用免疫细胞化学技术检测UCN在分离的肺肥大细胞中的表达，并通过甲苯胺蓝染色和透射电镜观察评价UCN对体外培养的肺肥大细胞活化脱颗粒的影响。结果雾化吸入10-5M UCN显著促进了肥大细胞在大鼠肺组织的聚集浸润，UCN这一效应显著被Astressin和Cromolyn所削弱。体外实验表明，分离的大鼠肺肥大细胞明显表达UCN；甲苯胺蓝染色和透射电镜结果显示，UCN(10-7、10-6、10-5M)显著促进了肺肥大细胞的活化脱颗粒，UCN这一效应被选择性CRHR1拮抗剂Antalarmin显著抑制，而特异性CRHR2拮抗剂Anti-svg-30对UCN的这一效应没有显著影响。结论雾化吸入UCN通过CRHR诱导肥大细胞在肺组织聚集浸润；UCN通过CRHR1促进大鼠肺肥大细胞的活化脱颗粒。第五章Urocortin对大鼠肺组织肥大细胞内钙离子浓度的影响目的细胞内钙离子浓度的升高是诱发肥大细胞脱颗粒的重要原因之一。本实验旨在研究UCN对大鼠肺肥大细胞内钙离子浓度的影响，探讨UCN对肺肥大细胞活化脱颗粒的相关机制。方法通过激光共聚焦显微镜和流式细胞仪记录UCN干预后肺肥大细胞内钙离子浓度的变化。结果激光共聚焦显微镜记录结果显示，在10-5M UCN干预后300 s时，肥大细胞内钙离子浓度出现一个快速增长的峰值，随后降低到一个相对稳定的持续的平台期。UCN诱发的[Ca2+]i峰值被antalarmin显著抑制，而Anti-svg-30对UCN的这一效应没有显著影响。流式细胞仪测细胞内钙也得到一致的结果。结论UCN通过CRHR1促进大鼠肺肥大细胞内钙离子浓度升高。第六章地塞米松对哮喘大鼠肺组织urocortin表达的影响目的糖皮质激素能降低哮喘炎症气道中许多炎症介质和细胞因子的合成和释放，本研究旨在观察地塞米松对哮喘大鼠肺组织UCN表达的影响。方法通过肺组织HE染色和肺泡盥洗液炎症细胞计数评价支气管哮喘大鼠气道炎症。采用RT-PCR半定量检测UCN mRNA的表达；采用免疫组化和Western blotting技术观察大鼠肺组织UCN肽的表达。结果哮喘大鼠肺组织形成显著的炎症病理改变，肺泡盥洗液中炎症细胞浸润显著增多，肺组织UCN mRNA和肽的表达均显著增高；地塞米松显著减轻了哮喘气道炎症，同时明显抑制了肺组织UCN mRNA和肽的表达。结论地塞米松抑制了UCN在支气管哮喘大鼠肺组织中的高表达。第二部分CRH & Urocortin与LDLR-／-小鼠动脉粥样硬化发生发展关系的研究动脉粥样硬化（Atherosclerosis，AS）所致的心、脑血管疾病严重危害着人类的生命健康。Ross的AS炎症假说已成为当前的主要学说，其认为AS是一种慢性炎症性疾病，炎症反应贯穿于AS起始、病变进展及斑块破裂、血栓形成的全过程。该学说转变了人们的观念，开辟了AS研究的新纪元。中枢产生的CRH和UCN通过HPA轴发挥间接的免疫抑制作用。可是外周CRH和UCN可能通过活化多种炎症细胞发挥强大的致炎作用。研究表明，外周循环的CRH通过影响单核、巨噬细胞的功能，促进了CRH（应激）相关的动脉内皮功能紊乱和心血管并发症的发生。本研究利用LDLR-／-小鼠，探讨CRH和UCN在AS损害处的表达情况以及它们对AS形成的影响和机制。对进一步探讨AS发病机理、寻找防治AS和逆转其病变的药物作用新靶点具有十分重要的意义。第一章CRH和urocortin在LDLR-／-小鼠动脉表达显著增多目的观察CRH和UCN在C57BL／6J小鼠和LDLR-／- AS小鼠动脉表达的差异。方法通过HE染色和血脂检测评价LDLR-／-小鼠AS病变程度。采用RT-PCR半定量检测CRH和UCN mRNA的表达；利用免疫组化技术观察CRH和UCN肽的表达强度；同时采用ELISA法定量检测两组小鼠血清和血管组织中CRH和UCN肽的表达差异。结果LDLR-／-小鼠血脂显著升高并且发展成明显的AS病变。与C57BL／6J对照小鼠相比，LDLR-／-小鼠动脉CRH和UCN mRNA和肽的表达均显著增高；ELISA结果表明，LDLR-／-小鼠血清CRH和UCN含量也显著升高。结论CRH和UCN在LDLR-／-小鼠动脉和血清中表达显著增多。第二章CRH和urocortin对LDLR-／-小鼠AS形成的影响目的观察CRH和UCN对LDLR-／-小鼠AS形成的影响。方法通过HE染色和血脂检测评价小鼠AS病变程度；通过化学比色法检测血清MDA含量、SOD活性以及总抗氧化能力。结果LDLR-／-小鼠血脂显著升高并且发展成明显的AS病变；CRH显著加剧了LDLR-／-小鼠AS斑块的发展，但UCN却没有显著影响，CRH和UCN对LDLR-／-小鼠的血清脂质含量均没有显著影响。与C57BL／6J对照小鼠相比，LDLR-／-小鼠体重增加较快，血清MDA含量明显升高，总抗氧化能力显著降低，但CRH和UCN对LDLR-／-小鼠的体重、血清MDA含量和总抗氧化能力均无显著影响。各组之间SOD的活性没有统计学差异。结论CRH加剧了LDLR-／-小鼠动脉粥样硬化病变的发展，CRH的促动脉粥样硬化作用可能并不是通过影响血脂和机体抗氧化能力实现的。第三章CRH对LDLR-／-小鼠AS发生发展的影响及受体机制目的观察CRH对LDLR-／-小鼠AS形成的影响以及受体机制。方法通过HE染色和血脂检测评价小鼠AS病变程度；通过化学比色法检测血清MDA含量、SOD活性以及总抗氧化能力。结果LDLR-／-小鼠血脂显著升高并且发展成明显的AS病变；CRH显著加剧了LDLR-／-小鼠AS斑块的发展，这一促AS效应被选择性CRHR1拮抗剂NBI27914显著削弱，但特异性CRHR2拮抗剂Anti-svg-30没有显著影响，CRH、NBI27914和Anti-svg-30对LDLR-／-小鼠血清脂质水平均无显著影响。与C57BL／6J对照小鼠相比，LDLR-／-小鼠体重增加较快，血清MDA含量明显升高，总抗氧化能力显著降低，但CRH、NBI27914和Anti-svg-30对LDLR-／-小鼠的体重、血清MDA含量和总抗氧化能力均无显著影响。各组之间SOD的活性没有统计学差异。结论cRH加剧了LDLR-／-小鼠AS病变的发展，CRH的促AS作用可能是由CRHR1介导的。第四章CRH对LDLR-／-小鼠IL-6水平、血管内皮VCAM-1表达和NF-κB活化的影响目的观察CRH对LDLR-／-小鼠IL-6水平及血管内皮VCAM-1表达和NF-κB活化的影响。方法通过ELISA法检测IL-6水平；采用RT-PCR检测血管VCAM-1 mRNA的表达；利用免疫组化技术观察血管VCAM-1表达和NF-κB活化的程度。结果LDLR-／-小鼠血清和血管组织IL-6水平均明显升高，CRH长期给药导致血清和血管组织产生更高水平IL-6，而NBI27914显著降低了CRH的这种升高IL-6效应；RT-PCR和免疫组化结果均显示，LDLR-／-小鼠血管VCAM-1表达显著增强，CRH长期给药后VCAM-1表达更为显著，而NBI27914显著降低了VCAM-1表达；免疫组化还显示，LDLR-／-小鼠血管NF-κB活化明显增多，CRH促进了更多的NF-κB活化，而NBI27914显著抑制了CRH诱导的NF-κB活化；Anti-svg-30对CRH诱导的IL-6水平、血管内皮VCAM-1表达和NF-κB活化均无显著影响。结论CRH可能通过活化CRHR1促进了LDLR-／-小鼠动脉NF-κB活化和VCAM-1表达，并且升高了IL-6水平。这些可能是CRH促进AS的部分重要分子机制。第五章CRH对LDLR-／-小鼠动脉壁单核巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞浸润数量的影响目的观察CRH对LDLR-／-小鼠血管壁单核巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞浸润的影响。方法通过免疫组化技术检测LDLR-／-小鼠动脉CD68、CD3和Tryptase的表达，以评价单核巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞的浸润情况。结果与C57BL／6J小鼠相比，LDLR-／-小鼠血管内皮粘附的单核细胞或内膜浸润的巨噬细胞显著增多；血管外膜浸润的肥大细胞和淋巴细胞也明显增多。CRH长期干预导致血管内皮粘附的单核细胞或内膜浸润的巨噬细胞数量更多，外膜浸润的肥大细胞也显著增多，CRH的这一效应被NBI27914显著抑制；而Anti-svg-30无显著影响。CRH干预并没有影响LDLR-／-小鼠血管壁淋巴细胞浸润的数量。结论CRH促进了单核巨噬细胞在内皮的粘附和内膜的浸润，并且增加了肥大细胞在血管外膜的数量，CRHR1介导的这些效应可能是CRH促进AS的一些细胞机制。

全文目录


英文缩略词表  5-6
中文摘要  6-14
英文摘要  14-24
第一部分 Urocortin与支气管哮喘相关性的研究  24-86
  前言  24-29
  第一章 Urocortin在大鼠肺组织中的表达情况  29-37
    引言  29
    材料和方法  29-33
    实验结果  33-35
    讨论  35-36
    参考文献  36-37
  第二章 Urocortin在支气管哮喘大鼠肺组织中表达显著增多  37-47
    引言  37-38
    材料和方法  38-40
    实验结果  40-44
    讨论  44-45
    参考文献  45-47
  第三章 Urocortin对大鼠肺血管通透性的影响及机制  47-57
    引言  47-48
    材料和方法  48-50
    实验结果  50-54
    讨论  54-56
    参考文献  56-57
  第四章 Urocortin对大鼠肺组织肥大细胞浸润和活化脱颗粒的影响  57-68
    引言  57
    材料和方法  57-60
    实验结果  60-65
    讨论  65-66
    参考文献  66-68
  第五章 Urocortin对大鼠肺组织肥大细胞内钙离子浓度的影响  68-77
    引言  68
    材料和方法  68-70
    实验结果  70-75
    讨论  75-76
    参考文献  76-77
  第六章 地塞米松对哮喘大鼠肺组织Urocortin表达的影响  77-85
    引言  77
    材料和方法  77-79
    实验结果  79-83
    讨论  83-84
    参考文献  84-85
  结论  85-86
第二部分 CRH & Urocortin与LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化发生发展关系的研究  86-145
  前言  86-98
  第一章 CRH和Urocortin在LDLR-/-小鼠动脉表达显著增多  98-109
    引言  98
    材料和方法  98-102
    实验结果  102-107
    讨论  107-108
    参考文献  108-109
  第二章 CRH和Urocortin对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响  109-117
    引言  109
    材料和方法  109-111
    实验结果  111-114
    讨论  114-116
    参考文献  116-117
  第三章 CRH对LDLR-/-小鼠动脉粥样硬化形成的影响及受体机制  117-126
    引言  117
    材料和方法  117-119
    实验结果  119-123
    讨论  123-124
    参考文献  124-126
  第四章 CRH对LDLR-/-小鼠IL-6水平、血管内皮VCAM-1表达和NF-kB活化的影响  126-136
    引言  126
    材料和方法  126-128
    实验结果  128-132
    讨论  132-135
    参考文献  135-136
  第五章 CRH对LDLR-/-小鼠动脉壁单核巨噬细胞、淋巴细胞和肥大细胞浸润数量的影响  136-144
    引言  136-137
    材料和方法  137-138
    实验结果  138-141
    讨论  141-143
    参考文献  143-144
  结论  144-145
博士在读期间发表的与本论文相关的文章  145-146
致谢  146-147
综述  147-176

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中图分类: > 医药、卫生 > 药学 > 药理学
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