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Urocortin在大鼠血栓闭塞性脉管炎中的作用和对COX-2表达的影响及机制的研究

作　者: 张荣建
导　师: 李胜男
学　校: 南京医科大学
专　业: 药理学
关键词: 血栓闭塞性脉管炎促肾上腺皮质激素释放因子受体环加氧酶2 大鼠主动脉内皮细胞 urocortin
分类号: R363
类　型: 硕士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

血栓闭塞性脉管炎(thromboangitis obilterans, TAO)是一种炎症性、闭塞性和周期发作的慢性周围血管病,多发于青壮年男性,主要侵犯四肢远端的中小动静脉,尤其是下肢血管,是青壮年男性肢体缺血及致残的主要原因之一。病理变化为血管壁节段性、非化脓性炎症伴腔内血栓形成,阻塞管腔引起肢体缺血、疼痛,呈周期性发作,最终引起肢端坏疽。目前只知TAO发病诱因为寒冻、吸烟以及性激素等,而其发病机理尚未完全阐明,还没有哪一种观点可以解释TAO的所有临床表现;同时该病的治疗方法和使用的药物不尽相同,疗效报道不一,仍为医学领域的难题之一。因此,探索TAO发病机理有着重大的理论与实际意义。Urocortin(Ucn)是一个40个氨基酸的多肽,属于促肾上腺皮质激素释放因子(corticotrophin-releasing factor, CRF)肽类家族。Ucn通过结合CRF受体(corticotrophin-releasing factor receptors, CRFRs)发挥多种生物学效应。近年来包括本实验室在内的研究表明,外周的Ucn作为一个自分泌或旁分泌的促炎因子参与很多炎性疾病,如风湿性关节炎、骨性关节炎、溃疡性结肠炎等。而且在很多炎症状态下,Ucn能促进炎性介质的释放,加重炎症。另外,Ucn还被报道参与了血管内皮功能紊乱。环加氧酶2 (cyclooxygenase-2, COX-2),作为一种参与花生四烯酸代谢的限速酶,被广泛报道参与各种炎症,包括血管炎症(动脉粥样硬化、TAO)。有研究表明,和正常人相比,TAO病人肱动脉内皮依赖性舒张能力下降了近50%,而选择性COX-2抑制剂则明显改善血管内皮功能。同时,Fiessinger等人多次临床病例对照试验结果也支持COX-2和TAO的关系。另一方面,近年来的很多文献支持Ucn和COX-2在炎症中的关系。Ucn能促进COX-2的表达从而参与了一系列的炎性疾病,如风湿性关节炎、血管炎等。而且,COX-2途径参与了Ucn诱导的炎症介质(如TNF-α、IL-6)的释放。更为重要的是,选择性COX-2抑制剂能取消Ucn引起的上述效应,缓解炎症。综上所述,鉴于TAO的血管炎本质和Ucn的促炎作用(包括参与血管内皮功能紊乱),我们推测Ucn与TAO可能有着非常密切的联系。那么究竟Ucn对TAO的发生发展有无影响?有何影响?COX-2是否参与了Ucn的上述作用?至今还未见报道。本文第一部分采用月桂酸钠注射大鼠股动脉复制TAO大鼠模型,研究Ucn、COX-2在TAO大鼠病变血管和血液中的表达,探索Ucn对TAO发生发展的影响,评价COX-2在TAO中的作用;第二部分利用体外分离培养的大鼠主动脉内皮细胞(RAECs),旨在细胞水平上研究Ucn对大鼠血管内皮炎症(LPS预先刺激造模)中COX-2表达的影响,并探讨相应受体和细胞内信号通路机制。第一部分Urocortin在大鼠血栓闭塞性脉管炎中的作用及对血管COX-2表达的影响目的:研究Ucn对大鼠TAO发生发展的影响,评价COX-2在TAO中的作用,探索TAO的发病机理。方法:月桂酸钠注射大鼠股动脉复制TAO动物模型,并以第十二天各组大鼠患肢的外观进行病变分级。H-E染色用来观察大鼠股动脉的形态学改变;大鼠的血液学指标(包括血常规、凝血和血液流变学指标)用于生化检测;ELISA用于检测血浆Ucn、TXB2和PGE2的水平;RT-PCR和Western blotting用于检测大鼠股动脉Ucn、CRFR1/2和COX-2的表达。结果:在造模后的第十二天大多数大鼠呈典型的TAO症状和体征。和假手术大鼠相比,TAO模型大鼠血液呈高凝状态,血浆内源性Ucn、PGE2水平显著升高,股动脉Ucn、CRFR1、CRFR1α和COX-2表达明显增加。给予外源性Ucn则进一步加重了高凝状态,促进了COX-2和PGE2的表达,恶化了TAO。Ucn的上述效应能被选择性CRFR1拮抗剂NBI-27914或非选择性CRFRs拮抗剂astressin阻断,然而选择性CRFR2拮抗剂antisauvagine-30则对Ucn组大鼠无明显作用。结论: Ucn能促进TAO大鼠血液高凝状态、COX-2的表达,加重脉管炎。上述作用是由CRFR1介导的。而血小板和COX-2可能是Ucn对TAO影响的潜在靶点。第二部分Urocortin对大鼠主动脉内皮细胞COX-2表达影响及机制的研究目的:研究Ucn对大鼠血管内皮炎症(LPS预先刺激造模)中COX-2表达的影响,并探讨相应的受体和细胞内信号通路机制。方法:大鼠主动脉内皮细胞(RAECs)的分离、培养和鉴定。实验均采用生长稳定的5-8代RAECs。RT-PCR和Western blotting分别用于检测COX-2 mRNA和蛋白的表达。ELISA用于检测细胞上清液中PGE2的含量;Western blotting检测MAPKs (p38MAPK、ERK1/2、JNK)、Akt和NF-κB的磷酸化水平;免疫荧光细胞化学法检测RAECs内NF-κB的核转位情况。结果:Ucn呈时间和浓度依赖性地增强LPS刺激下的RAECs中COX-2的表达;而且上调的COX-2 mRNA和蛋白分别在4h和8h达到峰值。Ucn的上述作用能被CRFR2拮抗剂antisauvagine-30完全阻断,而CRFR1拮抗剂NBI-27914却没有明显的作用。ELISA检测各组细胞上清液PGE2的结果也进一步证实了上述的发现。更为重要的是p38MAPK和NF-κB参与了RAECs上CRFR2介导的COX-2表达,而ERK1/2、JNK和Akt无明显改变。结论:Ucn通过CRFR2增强了LPS刺激下的RAECs中COX-2的表达从而参与了血管炎症,而且p38MAPK和NF-κB参与了CRFR2介导的上述效应。综上所述,本文工作的主要创新之处在于:1.整体实验揭示了Ucn对TAO大鼠血管炎有显著地促进作用,其机制与加重血液高凝和上调COX-2等相关,为探索TAO的发病机理积累了学术基础。2.离体实验表明Ucn上调了RAECs中COX-2的表达从而参与了血管炎症,其机制是由CRFR2介导的,与p38MAPK、NF-κB信号通路的激活相关,为血管炎症的药物治疗提供了新的靶标。3.整体和离体实验结果提示COX-2途径是Ucn参与血管炎症的重要机制之一。研究结果为血管炎症的防治提供了理论依据。

全文目录

英文缩略词表  5-7
中文摘要  7-11
英文摘要  11-16
前言  16-24
  参考文献  20-24
第一部分 Urocortin在大鼠血栓闭塞性脉管炎中的作用及对血管COX-2表达的影响  24-60
  引言  24-25
  第一节 Urocortin、CRFR1及COX-2在TAO大鼠血管中表达显著增加  25-38
  第二节外源性Urocortin对TAO大鼠相关指标的影响  38-46
  第三节 Urocortin对TAO大鼠血管COX-2、PGE2表达的影响及相应的受体机制  46-53
  结论  53
  参考文献  53-60
第二部分 Urocortin对大鼠主动脉内皮细胞COX-2表达影响及机制的研究  60-88
  引言  60-61
  第一节 Urocortin 对大鼠主动脉内皮细胞 COX-2 表达影响及相应的受体机制  61-74
  第二节 Urocortin 对LPS 刺激的RAECs 中COX-2 表达信号通路的影响  74-82
  结论  82
  参考文献  82-88
综述  88-91
附录  91-92
致谢  92

Urocortin在大鼠血栓闭塞性脉管炎中的作用和对COX-2表达的影响及机制的研究

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