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海洋嗜杀酵母的筛选、嗜杀因子的纯化及其基因的克隆

作　者: 王祥红
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 海洋生物
关键词: 海洋嗜杀酵母 嗜杀因子 梭子蟹 乳化病 β-1，3-D-葡聚糖酶
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2007年
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内容摘要


通过人工感染实验确定了酵母菌WCY为梭子蟹的病原菌,感染实验的梭子蟹的症状同梭子蟹“乳化病”症状相同;通过形态、生理生化和分子生物学鉴定,鉴定病原酵母菌WCY为梅奇酵母(Metschnikowia bicuspidata)。从海洋中分离的327株酵母中筛选出13株对病原酵母WCY有抑制作用的嗜杀酵母,对其抑菌效果做了比较,其中菌株YF07b具有最佳的抑菌效果。通过生理生化和分子生物学方法对海洋嗜杀酵母进行鉴定,结果显示在海洋嗜杀酵母中,汉逊德巴利酵母(Debaryomyces hansenii)、季也蒙毕赤酵母(Pichia guilliermondii)、普鲁兰类酵母(Aureobasidium pullulans)和异常毕赤酵母(Pichia anomala)最常见,其中异常毕赤酵母(Pichia anomala)的抑菌能力最强。研究了菌株YF07b的嗜杀因子在不同NaCl浓度(0%,3%,6%,8%)、温度(15,20,25,30,35℃)、pH(4.0, 4.5, 5.0, 6.0, 7.0, 8.0)值条件下的抑菌效果。嗜杀因子的最佳作用条件是NaCl浓度8%、pH为4.5,培养温度为15℃。研究了菌株YF07b的发酵培养条件,结果表明当海洋嗜杀酵母YF07b在温度为20℃,培养基中NaCl浓度为2.0%,pH为4.5时产生嗜杀因子的能力最强。分离筛选的海洋嗜杀酵母YF07b经常规生理生化反应和分子生物学鉴定,为异常毕赤酵母(Pichia anomala),根据陆地嗜杀酵母Pichia anomala strain K的嗜杀因子(β-1,3-葡聚糖酶)的基因及相关序列设计引物克隆菌株YF07b的嗜杀因子基因序列,克隆得到的基因序列为1589bp,GenBank登录号为EF029071。与其它相关蛋白序列对比分析,确定此嗜杀因子基因的编码区(ORF框)为209 bp到1492bp。克隆基因的推导蛋白为427个氨基酸,推导蛋白与其他酵母菌相关蛋白的氨基酸序列的系统发育分析比对,与异常毕赤酵母(Pichia anomala Strain K)的亲缘关系最近。信号肽分析结果表明,推导蛋白的前17个氨基酸为信号肽嗜杀因子经Sephadex G75凝胶过滤和DEAE-Sephorose Fast Flow阴离子交换得到纯化,经SDS-PAGE检测得到分子量为47kDa的单一条带。纯化后的嗜杀因子有β-1,3-葡聚糖酶活性,并且纯化后的嗜杀因子仍具有抑菌活性。纯化的嗜杀因子的最适作用温度为40℃,温度在60℃以下能保持稳定;在pH4.5时嗜杀因子的酶活最高,并且嗜杀因子在pH为3.0到5.0时是稳定的;Ca2+, Co2+, K+和Mg2+对嗜杀因子的活性有激活作用,而Fe2+, Fe3+, Hg2+, Cu2+, Mn2+, Zn2+和Ag+对其活性有抑制作用;蛋白抑制剂1,10-菲罗啉,EDTA,SDS,PMSF和碘乙酸对嗜杀因子的β-1,3-D-葡聚糖酶酶活有抑制作用。嗜杀因子的米氏常数Km为1.17 mg/ml,Vmax为72.5μmol/min.mg;嗜杀因子水解海带多糖的产物为小分子的糖(单糖和双糖)。

全文目录


中文摘要  9-11
英文摘要  11-13
第一章 绪论  13-47
  1 养殖蟹类病原菌  13-18
    1.1 细菌  13-15
      1.1.1 弧菌  13-14
      1.1.2 其它细菌  14-15
    1.2 真菌  15-16
    1.3 蟹类原核样微生物病原  16-17
    1.4 病毒  17-18
  2 梭子蟹养殖现状以及病害发生概况  18-20
    2.1 梭子蟹养殖现状  18
    2.2 梭子蟹养殖病害发生概况  18-19
    2.3 梭子蟹“乳化病”的概况  19-20
  3 酵母在海洋环境中的分布与多样性  20-26
    3.1 酵母菌细胞密度  20
    3.2 酵母菌在河口和红树林区域的分布  20-23
    3.3 远海与深海环境中的酵母菌  23-26
  4 海洋酵母菌资源  26-32
    4.1 产纤维素的海洋酵母  27
    4.2 产菊糖酶的海洋酵母  27-28
    4.3 产碱性蛋白酶的海洋酵母  28-29
    4.4 产淀粉酶的海洋酵母  29
    4.5 产脂酶的海洋酵母  29-30
    4.6 产嗜杀因子的海洋酵母  30-31
    4.7 产植酸酶的海洋酵母  31-32
  5 嗜杀酵母和嗜杀因子的作用机理  32-46
    5.1 酿酒酵母嗜杀系统  32-36
    5.2 Ustilago maydis 嗜杀系统  36-38
    5.3 Kluyveromyces lactis 嗜杀系统  38-39
    5.4 Pichia 和Williopsis 嗜杀系统  39-42
    5.5 其它酵母嗜杀系统  42-44
    5.6 嗜杀因子的应用  44-46
      5.6.1 嗜杀酵母在发酵工业中的应用  44
      5.6.2 嗜杀因子作为潜在抗真菌药物  44-45
      5.6.3 在抗水果蔬菜腐烂中的应用  45
      5.6.4 在转基因植物中的应用  45
      5.6.5 在酵母菌基因工程中的应用  45-46
  6 论文的研究内容、意义与技术路线  46-47
第二章 梭子蟹病原酵母菌 WCY 的鉴定及致病性研究  47-59
  前言  47
  1 材料与方法  47-51
    1.1 病原酵母菌株  47
    1.2 健康梭子蟹及暂养  47-48
    1.3 培养基  48
    1.4 病原酵母菌的培养  48
    1.5 梭子蟹的病原菌感染实验  48
    1.6 病原酵母的菌种鉴定  48-51
      1.6.1 常规形态特征和生理生化鉴定  48-50
      1.6.2 酵母菌分子生物学鉴定  50-51
  2 结果  51-56
    2.1 梭子蟹人工感染实验结果  51-53
    2.2 酵母菌常规形态特征和生理生化反应实验结果  53-56
      2.2.1 酵母菌WCY 形态特征  53-54
      2.2.2 酵母菌WCY 生理生化反应实验结果  54
      2.2.3 酵母菌WCY 分子生物学鉴定实验结果  54-56
  3 讨论  56-58
  4 小结  58-59
第三章 海洋嗜杀酵母的筛选与鉴定  59-70
  前言  59-60
  1 材料与方法  60-61
    1.1 样品来源  60
    1.2 海洋酵母的分离  60
    1.3 嗜杀酵母筛选培养基  60
    1.4 嗜杀酵母的筛选  60-61
    1.5 嗜杀酵母的菌种鉴定  61
  2 结果  61-67
    2.1 海洋嗜杀酵母筛选结果  61-63
    2.2 海洋嗜杀酵母菌种鉴定结果  63-67
  3 讨论  67-69
  4 小结  69-70
第四章 菌株YF076产嗜杀因子的发酵条件与嗜杀因子最佳抑菌条件研究  70-80
  前言  70-71
  1 材料和方法  71-72
    1.1 嗜杀酵母菌种  71
    1.2 嗜杀酵母活性检测培养基  71
      1.2.1 盐度检测培养基  71
      1.2.2 温度检测培养基  71
      1.2.3 pH 检测培养基  71
    1.3 嗜杀酵母发酵培养基  71
      1.3.1 嗜杀因子发酵基本培养基  71
      1.3.2 盐度实验培养基  71
      1.3.3 温度实验培养基  71
      1.3.4 pH 实验培养基  71
    1.4 嗜杀酵母的发酵培养  71-72
    1.5 嗜杀因子的浓缩  72
    1.6 嗜杀因子抑菌活性的检测  72
  2 结果  72-78
    2.1 盐度、温度和pH 值对嗜杀因子抑菌作用的影响  72-75
    2.2 盐度、温度和pH 值对菌株YF076 发酵产生嗜杀因子的影响  75-78
  3 讨论  78-79
  4 小结  79-80
第五章 海洋嗜杀酵母YF076 嗜杀因子基因的克隆及推导蛋白序列分析  80-94
  前言  80
  1 材料与方法  80-85
    1.1 嗜杀酵母菌株  80
    1.2 培养基和试剂配制  80-81
    1.3 酵母菌基因组总DNA 的提取  81
    1.4 引物设计  81
    1.5 嗜杀因子基因的PCR 扩增  81-82
    1.6 PCR 产物的回收  82
    1.7 PCR 产物的克隆  82-85
      1.7.1 连接反应  82
      1.7.2 大肠杆菌感受态细胞的制备  82-83
      1.7.3 转化大肠杆菌  83
      1.7.4 阳性克隆的筛选  83
      1.7.5 质粒的提取  83-85
      1.7.6 阳性质粒的PCR 及双酶切验证  85
      1.7.7 琼脂糖电泳检测 PCR 结果及测序  85
      1.7.8 推导蛋白的序列分析  85
  2 结果  85-91
    2.1 嗜杀因子基因扩增、PCR 产物回收及转化质粒连接的鉴定  85-87
    2.2 嗜杀因子基因测序结果及分析  87-89
    2.3 嗜杀因子基因编码推导蛋白的分析  89-91
  3 讨论  91-93
    3.1 嗜杀因子的基因克隆  91-92
    3.2 嗜杀因子推导蛋白的分析  92-93
  4 小结  93-94
第六章 海洋酵母菌YF076嗜杀因子的纯化及特性研究  94-113
  前言  94-95
  1 材料与方法  95-100
    1.1 嗜杀酵母菌种  95
    1.2 嗜杀因子发酵培养基  95
    1.3 嗜杀酵母YF076 的培养  95
    1.4 嗜杀因子的粗酶浓缩液的制备  95
    1.5 总蛋白含量的测定  95
    1.6 嗜杀因子β-1,3-D-葡聚糖酶活力的测定  95
    1.7 嗜杀因子样品的平衡  95
    1.8 Sephadex G75 凝胶过滤  95-96
      1.8.1 凝胶的处理和装柱  95-96
      1.8.2 平衡  96
      1.8.3 上样和洗脱  96
    1.9 DEAE-Sephorose Fast Flow 阴离子交换  96
    1.10 超滤浓缩收集液  96-97
    1.11 不连续SDS 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE )  97-98
      1.11.1 电泳试剂  97
      1.11.2 考马斯亮蓝染色试剂和方法  97
      1.11.3 SDS-PAGE 流程  97-98
    1.12 培养时间对嗜杀因子β-1,3-D-葡聚糖酶活力的影响  98
    1.13 嗜杀因子（β-1,3-D-葡聚糖酶）的最适反应温度和温度稳定性  98
    1.14 嗜杀因子（β-1,3-D-葡聚糖酶）的最适反应pH 和pH 稳定性  98-99
    1.15 金属离子对嗜杀因子酶活力的影响  99
    1.16 蛋白抑制剂对嗜杀因子酶活力的影响  99
    1.17 嗜杀因子酶的动力学常数（Km 值和Vmax）的测定  99
    1.18 嗜杀因子水解海带多糖的产物分析  99-100
  2 结果  100-109
    2.1 嗜杀因子的纯化  100-103
    2.2 培养时间对嗜杀酵母β-1,3-D-葡聚糖酶活力的影响  103-104
    2.3 纯化嗜杀因子作用的最适温度和温度稳定性  104
    2.4 纯化嗜杀因子作用的最适pH 和pH 稳定性  104
    2.5 不同金属离子对纯化嗜杀因子的作用  104-105
    2.6 不同蛋白抑制剂对纯化嗜杀因子酶活力的影响  105
    2.7 嗜杀因子的β-1,3-D-葡聚糖酶反应动力学常数（Km 值和Vmax）  105
    2.8 嗜杀因子海带多糖水解产物的分析  105-109
  3 讨论  109-112
    3.1 嗜杀因子的纯化  109
    3.2 嗜杀因子作用的最适温度和温度稳定性  109
    3.3 嗜杀因子作用的最适pH 和pH 稳定性  109-110
    3.4 不同金属离子对纯化嗜杀因子的作用  110
    3.5 不同蛋白抑制剂对嗜杀因子酶活力的影响  110-111
    3.6 嗜杀因子的β-1,3-D-葡聚糖酶反应动力学常数（Km 值和Vmax）  111-112
  4 小结  112-113
论文总结  113-115
论文的创新点与展望  115-117
  1 论文的创新之处  115-116
  2 展望  116-117
参考文献  117-125
攻读博士期间已完成与发表的论文与成果  125-126
致谢  126

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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