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土星拟威尔酵母WC91-2菌株嗜杀因子和β-1，3-葡聚糖酶的研究

作　者: 彭莹
导　师: 池振明
学　校: 中国海洋大学
专　业: 微生物学
关键词: 海洋嗜杀酵母 嗜杀因子 β-1,3-葡聚糖酶 基因克隆 表达
分类号: Q93
类　型: 博士论文
年　份: 2010年
下　载: 46次
引　用: 2次
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内容摘要


分离纯化了海洋嗜杀酵母Williopsis saturnus WC91-2菌株的β-1,3-葡聚糖酶,经SDS-PAGE检验是分子量为47.5kDa的单一蛋白。纯化的β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖的产物是单糖和二糖,具有外切β-1,3-葡聚糖酶活性,没有嗜杀活性,其二级质谱结果证实所纯化蛋白为外切β-1,3-葡聚糖酶,含有序列YIEAQLDAFEKR。纯化的β-1,3-葡聚糖酶,其最适作用温度为40℃,50℃以下稳定；最适作用pH值为4.0,在pH 3-7.5之间较稳定；Ba2+、Ni2+和Li+对β-1,3-葡聚糖酶的活性具有显著的激活作用,Zn2+、Mg2+、Ca2+、Na+、Fe3+、Fe2+、K+和Co2+对其酶活具有抑制作用,Hg2+、Cu2+、Mn2+和Ag+具有较强的抑制作用；蛋白抑制剂1,10-菲啰啉、EGTA、PMSF、EDTA、SDS和碘乙酸对其酶活均有抑制作用；纯酶的米氏常数Km值为3.07 mg/ml,Vmax值为4.02mg/(min*ml)。分离纯化了海洋酵母WC91-2菌株的嗜杀因子,它是分子量为11.0 kDa的单一蛋白,纯化的嗜杀因子仍具有嗜杀活性,但不能水解海带多糖,没有β-1,3-葡聚糖酶活性。对于纯化的WC91-2嗜杀因子,当检测培养基中的NaCl浓度为10.0%(w/v)时对敏感酵母菌株WCY的抑菌圈直径最大；WC91-2嗜杀因子的最适作用温度为16℃,在0-30℃范围内稳定；最适作用pH值范围是pH 3-3.5,在pH 3.0-5.0范围内稳定。克隆得到WC91-2嗜杀因子的基因,其ORF框全长为378个碱基,编码125个氨基酸,基因序列与W. saturnus var.mrakii嗜杀因子的基因序列最为相似,信号肽预测结果表明N-端19个氨基酸为信号肽,推导蛋白分子量为11.6 kDa,与分离纯化的WC91-2嗜杀因子的分子量基本上相同。纯化的WC91-2β-1,3-葡聚糖酶对WC91-2嗜杀因子的嗜杀活性有抑制作用。通过纯化的嗜杀因子或者β-1,3-葡聚糖酶对海带多糖和敏感酵母WCY细胞的结合实验,推测β-1,3-葡聚糖酶与嗜杀因子竞争结合位于敏感菌株WCY细胞壁上的β-1,3-葡聚糖结合位点,从而导致嗜杀因子与细胞的结合程度降低,对细胞的作用减弱,抑菌圈变小,表现出β-1,3-葡聚糖酶对嗜杀因子的嗜杀活性产生了抑制作用,嗜杀因子的嗜杀活性下降的现象。WC91-2菌株的嗜杀因子不是通过水解细胞壁上的葡聚糖来杀死细胞的,也不直接作用于敏感酵母细胞的细胞膜,不能杀死敏感酵母WCY细胞的原生质体。推测WC91-2菌株嗜杀因子的初始结合位点很可能存在于敏感酵母细胞的细胞壁上,并且很可能是细胞壁β-1,3-葡聚糖。通过实验和电镜照片推测其杀菌机理为WC91-2菌株嗜杀因子的存在影响到了敏感酵母细胞内外的渗透压,细胞内压导致孔道形成,胞内物质在不完整的细胞壁脆弱部位喷出而造成细胞死亡。利用简并引物PCR、反向PCR及RT-PCR扩增得到编码WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的WsEXG1基因及两侧部分基因共3153bp。基因WsEXG1的DNA序列为1254bp,没有内含子,在NCBI的登录号为FJ875997.2。基因WsEXG1编码417个氨基酸,经预测前15个氨基酸为信号肽,有两个N-糖基化位点,预测分子量为46.2 kDa,预测等电点为4.5。分析WsEXG1基因序列,推测出其启动子位于-28到-77的位置,含有一个TATA框,但是没有CAAT框,其终止子在+1386到+1401的位置含有序列AAGAACAATAAACAA。推导蛋白与Pichia anomala和Candida albicans的β-1,3-葡聚糖酶分别有66.9%和59.4%的相似度。分析表明此蛋白含有糖基水解酶第5家族特征IGLELLNEPL,并含有一个序列为NLCGEWSAA的片段,其中的Glu-310(E)被认为是催化亲核体。利用pINA1317表达载体,将WC91-2菌株的WsEXG1基因在Yarrowia lipolytica Polh中成功进行了超表达,得到了一株β-1,3-葡聚糖酶活力较高的菌株1317-G80。纯化了重组β-1,3-葡聚糖酶,并对重组酶进行了Western blotting鉴定。SDS-PAGE显示纯化的重组β-1,3-葡聚糖酶的分子量约为46 kDa。对于纯化的重组β-1,3-葡聚糖酶,其最适作用温度为40℃,40℃以下稳定；最适作用pH为5.0,pH 5.0-9.5之间稳定；Ba2+对其酶活有激活作用,Co2+、Zn2+、Mn2+、Fe2+、Fe3+、Hg2+、Cu2+、Ag+、Ni2+对其酶活有抑制作用,其中Ag+、Hg2+和Fe3+表现出较强的抑制作用,Mg2+、Ca2+、Na+、K+、Li+、对酶活影响不大；蛋白抑制剂碘乙酸、EDTA、EGTA、PMSF、1,10-邻菲罗啉和SDS对其酶活有抑制作用；对于海带多糖的Km值为3.95mg/ml,Vmax值为2.3 mg/(min*ml)。重组β-1,3-葡聚糖酶能够将海带多糖水解成单糖,具有外切β-1,3-葡聚糖酶活性。

全文目录


摘要  5-7
Abstract  7-14
第一章 绪论  14-44
  1 海洋酵母菌资源概述  14-21
    1.1 海洋环境中的酵母菌资源  14-18
      1.1.1 海洋酵母菌的种类和分布  14-16
      1.1.2 深海热液生态系统的海洋酵母菌  16
      1.1.3 河口和红树林地区的海洋酵母菌  16-17
      1.1.4 海洋酵母菌的功能及应用  17-18
    1.2 海水养殖环境中的致病酵母菌  18-21
  2 嗜杀酵母和嗜杀因子  21-38
    2.1 自然界中的嗜杀现象  21-22
    2.2 嗜杀因子的特征  22-25
      2.2.1 嗜杀因子的生理生化性质  22-23
      2.2.2 产生嗜杀因子的条件  23-24
      2.2.3 嗜杀因子的作用特点  24
      2.2.4 嗜杀酵母的分离和嗜杀活性的检测  24-25
    2.3 海洋环境中的嗜杀酵母菌  25-27
    2.4 嗜杀因子的机理  27-34
      2.4.1 嗜杀因子的作用机制  28-33
      2.4.2 嗜杀酵母的免疫机制  33-34
    2.5 嗜杀酵母和嗜杀因子的应用  34-38
      2.5.1 嗜杀酵母菌在发酵工业中的应用  35
      2.5.2 嗜杀因子作为新型抗真菌药物的潜在应用  35-36
      2.5.3 在抗食品及饲料腐烂中的应用  36-37
      2.5.4 嗜杀因子在分类学上的应用  37
      2.5.5 在基因工程中的应用  37-38
  3 β-1,3-葡聚糖酶概述  38-42
    3.1 β-葡聚糖酶的底物——β-葡聚糖  38-39
    3.2 β-1,3-葡聚糖酶的分类和作用特点  39-40
    3.3 β-1,3-葡聚糖酶的功能  40-41
    3.4 真菌β-1,3-葡聚糖酶基因的研究现状  41-42
  4 论文的研究依据和主要的研究内容  42-44
第二章 海洋酵母W.saturnus WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶的纯化和特性研究  44-60
  0 前言  44
  1 材料与方法  44-51
  2 结果与讨论  51-59
    2.1 海洋酵母WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化  51-54
    2.2 β-1,3-葡聚糖酶对海带多糖水解产物的分析  54
    2.3 β-1,3-葡聚糖酶的嗜杀活性  54-55
    2.4 质谱分析鉴定  55
    2.5 β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度和温度稳定性  55-56
    2.6 β-1,3-葡聚糖酶的最适反应pH和pH稳定性  56-57
    2.7 不同金属离子对β-1,3-葡聚糖酶活性的影响  57
    2.8 不同蛋白抑制剂对β-1,3-葡聚糖酶活性的影响  57-58
    2.9 β-1,3-葡聚糖酶动力学常数的测定  58-59
  3 本章小结  59-60
第三章 海洋酵母W.saturnus WC91-2菌株嗜杀因子的纯化、性质和基因克隆  60-79
  0 前言  60
  1 材料与方法  60-69
  2 结果与讨论  69-78
    2.1 海洋酵母WC91-2菌株嗜杀因子的分离纯化  69-71
    2.2 纯化嗜杀因子的嗜杀活性  71
    2.3 嗜杀因子水解海带多糖的能力  71-72
    2.4 海洋酵母WC91-2菌株嗜杀因子的特性研究  72-74
      2.4.1 不同盐度条件下嗜杀因子的抑菌作用  72-73
      2.4.2 温度对嗜杀因子嗜杀活性的影响  73
      2.4.3 pH值对嗜杀因子嗜杀活性的影响  73-74
    2.5 海洋酵母WC91-2菌株嗜杀因子的基因克隆  74-78
      2.5.1 海洋酵母WC91-2菌株基因组DNA的提取  74-75
      2.5.2 嗜杀因子基因的PCR扩增结果  75-77
      2.5.3 嗜杀因子基因的测序结果及分析  77-78
  3 本章小结  78-79
第四章 海洋酵母W.saturnus WC91-2菌株嗜杀因子和β-1,3-葡聚糖酶之间的相互关系  79-89
  0 前言  79-80
  1 材料与方法  80-82
  2 结果与讨论  82-88
    2.1 WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶对纯化的嗜杀因子嗜杀活性的影响  82-84
    2.2 海带多糖或敏感菌株WCY细胞的吸附对纯化的WC91-2嗜杀因子嗜杀活性的影响  84-85
    2.3 纯化的β-1,3-葡聚糖酶与敏感酵母WCY细胞结合后对嗜杀因子嗜杀活性的影响  85
    2.4 WC91-2嗜杀因子对敏感酵母WCY细胞原生质体的嗜杀活性  85-87
    2.5 嗜杀因子作用于完整的敏感酵母WCY细胞  87-88
  3 本章小结  88-89
第五章 海洋酵母W.saturnus WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶的基因克隆与信息学分析  89-107
  0 前言  89-90
  1 材料与方法  90-96
  2 结果与讨论  96-106
    2.1 简并PCR克隆获得WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶的部分基因  96-98
    2.2 反向PCR克隆获得WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶的全部基因  98-101
    2.3 WsEXG1基因序列的信息学分析  101-102
    2.4 从WsEXG1基因推导的W.saturnus WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶蛋白的分析  102-106
  3 本章小结  106-107
第六章 海洋酵母WC91-2菌株β-1,3-葡聚糖酶基因的表达及重组酶的纯化、特性研究  107-127
  0 前言  107-108
  1 材料与方法  108-117
  2 结果与讨论  117-126
    2.1 表达质粒pINA1317-EXG1的构建  117-119
    2.2 含WsEXG1基因的大片段转化Y.lipolytica Po1h及阳性转化子的筛选  119
    2.3 阳性转化子的β-1,3-葡聚糖酶活性测定  119-120
    2.4 重组β-1,3-葡聚糖酶的分离纯化  120-122
    2.5 重组β-1,3-葡聚糖酶的性质研究  122-126
      2.5.1 重组β-1,3-葡聚糖酶的最适反应温度及温度稳定性  122
      2.5.2 重组β-1,3-葡聚糖酶的最适反应pH及pH稳定性  122-123
      2.5.3 不同金属离子对重组β-1,3-葡聚糖酶活力的影响  123
      2.5.4 不同蛋白抑制剂对重组β-1,3-葡聚糖酶活力的影响  123-124
      2.5.5 重组β-1,3-葡聚糖酶动力学常数的测定  124-125
      2.5.6 重组β-1,3-葡聚糖酶水解海带多糖的能力  125-126
  3 本章小结  126-127
论文的创新点与展望  127-128
参考文献  128-139
附录:英文缩写符号及其中英文名称  139-141
攻读博士学位期间发表的学术论文  141-142
致谢  142

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中图分类: > 生物科学 > 微生物学
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