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三疣梭子蟹微卫星富集文库的构建及五个野生地理群的多样性分析

作　者: 李晓萍
导　师: 刘萍；宋协法
学　校: 中国海洋大学
专　业: 渔业资源
关键词: 三疣梭子蟹富集文库微卫星野生群体多样性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 49次
引　用: 2次
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内容摘要

本文采用富集文库-菌落原位杂交法构建了三疣梭子蟹微卫星富集文库,分离筛选出30对扩增条带清晰稳定,多态性较高的引物,选取其中8对引物对我国由南到北五个群体(舟山、海州湾、青岛即墨会场、莱州湾、鸭绿江口)的野生三疣梭子蟹的遗传多样性进行了比较分析,对于加快育种进程,提高选择效率具有重要的意义。论文具体内容如下：1、利用富集文库-菌落原位杂交法筛选三疣梭子蟹微卫星标记,通过固定了(AC)15和(AG)15探针的尼龙膜(Hybond N+)捕捉含有微卫星的片段,转化至大肠杆菌DH5α中,构建三疣梭子蟹微卫星富集文库。菌落原位杂交后,任意选取150个克隆进行测序,得到124条序列,其中18个克隆的核心序列重复数太少或不含有重复序列,106个含重复序列的克隆中均只含有微卫星位点,阳性克隆率为85.48%。通过重复序列筛查去除冗余部分,得到103个独立克隆序列,其中完美型43个,占41.75%；非完美型8个,占7.767%；复合型52个,占50.48%,共176个微卫星位点。利用软件共设计了105对微卫星引物,81对引物能够得到清晰的预期长度的扩增片段,56对引物表现出多态性。用30个野生三疣梭子蟹个体进行遗传信息评价,结果显示30个位点在该群体中具有较高多态性。不同的位点获得的等位基因数目从3～13个不等,共获得238个等位基因,平均每个位点获得8.0个等位基因,观测杂合度、期望杂合度及多态性信息含量值的范围分0.2222～1.0000、0.4367～0.9099和0.350～0.892,研究结果表明富集文库-菌落原位杂交法适合于大规模筛选目标物种的微卫星标记。2、选取8对引物对三疣梭子蟹5个野生地理群体进行多样性分析,结果显示,8个位点在5个三疣梭子蟹群体的120个个体中共扩增得到72个等位基因,不同引物获得的等位基因数从6～12不等,平均每个位点获得的等位基因数目为9.0个。有效等位基因数在2.9058～7.7901之间,平均每个位点检测的有效等位基因数目为5.4677个。3、计算各位点的多态信息含量,8个位点在5个群体中得到的多态信息含量有所不同,其中位点PTR112在HZ群体中获得的多态信息含量最高为0.8349,而位点PTR103b在HZ群体中的多态信息含量最低为0.3794。统计各位点在各群体中的PIC值发现,只有两个PIC值低于0.5,属于中度多态性位点,其他PIC值均大于0.5。从8个位点在每个群体中的平均多态信息含量来看,PIC值从0.6748～0.7138不等,均大于0.5；从各微卫星位点的平均多态信息含量来看,PIC值在0.5394～0.8003之间,同样都大于0.5,平均多态信息含量为0.6967。由此可见,所选择的微卫星位点具有丰富的多态性,能够在分子水平上很好的反映5个地理群体间和群体内的遗传关系。4、8个位点在5个群体中所反映的群体杂合度有较大差异,其中位点PTR45在LZ群体的观测杂合度最高为0.9167,位点PTR103b在HZ群体的观测杂合度最低为0.4091。在某一个群体中的各位点的观测杂合度也差异较大,表明用单个位点进行群体杂合度的检测,其结果并不一定能够代表群体的真实杂合度水平,通常取多个位点杂合度的平均值。根据所得的杂合度平均值可知,5个群体的平均期望杂合度相差不大,以LZ群体的最高He=0.7704,ZS群体的杂合度最低He=0.7283；平均观测杂合度在0.6481～0.7604之间。观察5个群体的观测杂合度和期望杂合度发现,二者均相差较小,说明每个群体内的等位基因频率都未偏离HW平衡。通过对5个群体中各位点的卡方检验可知,除了LZ群体和HC群体的PTR145位点,HZ群体的PTR98a和PTR112位点以及ZS群体的PTR98a和PTR103b位点表现为显著和极显著偏离HW平衡外,其余位点均符合HW平衡。5、通过计算种群间的遗传距离和遗传相似性指数表明,三疣梭子蟹5个群体间的遗传距离在0.2451～0.5179之间,遗传相似性指数从0.5958～0.7826,其中HC和HZ的遗传距离最小,相似性最高,LZ和ZS的遗传距离最远,相似性最小。同时该结果也反映在UPGMA聚类树上,HC和HZ两个群体遗传距离最近先聚到一起,LZ群体与这4个群体的遗传距离较远,最后聚在一起。6、Fst值可以用来测量群体间的遗传分化程度,8个位点的遗传分化指数在0.0548～0.1083之间。从值Fst值的大小可以看出,5个群体间产生了中等程度的遗传分化(0.05<Fst<0.15),并且分化程度都达到了极显著水平。

全文目录

摘要  5-7
Abstract  7-11
1 文献综述  11-27
  1.1 三疣梭子蟹概述  11-15
    1.1.1 分类地位及地理分布  11
    1.1.2 形态特征  11-13
    1.1.3 生活习性  13-14
    1.1.4 繁殖习性  14-15
    1.1.5 发育和生长规律  15
  1.2 分子遗传标记概述  15-18
    1.2.1 限制性片段长度多态性  16
    1.2.2 随机扩增多态性DNA  16
    1.2.3 扩增片段长度多态性  16-17
    1.2.4 微卫星  17
    1.2.5 线粒体DNA  17
    1.2.6 单核苷酸多态性  17-18
  1.3 微卫星标记及分离方法  18-20
    1.3.1 微卫星的定义、分类和特点  18-19
    1.3.2 蟹类微卫星标记的分离方法  19-20
  1.4 三疣梭子蟹遗传学研究进展  20-25
    1.4.1 染色体分析  21
    1.4.2 同工酶电泳分析  21-22
    1.4.3 RAPD分析  22
    1.4.4 mtDNA分析  22-23
    1.4.5 AFLP分析  23-24
    1.4.6 SSR分析  24-25
  1.5 研究目的及意义  25-27
2 三疣梭子蟹微卫星文库的构建  27-42
  2.1 实验材料  27
    2.1.1 实验样品  27
    2.1.2 主要试剂和耗材  27
  2.2 实验方法  27-36
    2.2.1 基因组DNA提取与质量、浓度检测  27-28
    2.2.2 制备大肠杆菌感受态细胞  28
    2.2.3 富集文库的构建  28-36
  2.3 实验结果与分析  36-39
    2.3.1 基因组DNA的提取与定量  36
    2.3.2 基因组DNA的酶切和回收  36
    2.3.3 连接接头后PCR和洗膜后PCR  36-37
    2.3.4 插入片段长度检测  37-38
    2.3.5 阳性克隆显影  38
    2.3.6 测序结果和序列分析  38-39
    2.3.7 引物设计  39
  2.4 讨论  39-42
    2.4.1 微卫星标记筛选方法  40
    2.4.2 微卫星标记开发中探针的选择  40-42
3 三疣梭子蟹微卫星标记的筛选与评价  42-51
  3.1 微卫星引物的优化  42-43
    3.1.1 材料与方法  42
    3.1.2 实验结果  42-43
  3.2 多态性微卫星引物的筛选  43-46
    3.2.1 实验材料  43
    3.2.2 实验方法  43-45
    3.2.3 实验结果  45-46
  3.3 多态性微卫星引物的评价  46-51
    3.3.1 材料与方法  46
    3.3.2 实验结果  46-49
    3.3.3 讨论与分析  49-51
4 三疣梭子蟹5个野生地理群的多样性分析  51-63
  4.1 实验材料  51-52
  4.2 微卫星引物  52
  4.3 实验方法  52-54
  4.4 实验结果  54-60
    4.4.1 8个位点在群体中的扩增结果  54-56
    4.4.2 等位基因数和有效等位基因数  56
    4.4.3 多态信息含量  56-59
    4.4.4 观测杂合度、期望杂合度及Hardy-Weinberg平衡检验  59
    4.4.5 遗传距离和聚类分析  59-60
    4.4.6 群体遗传变异分析  60
  4.5 讨论与分析  60-63
    4.5.1 多态信息含量和杂合度  60-61
    4.5.2 五个地理群体的Hardy-Weinberg平衡  61
    4.5.3 群体亲缘关系  61-62
    4.5.4 群体间的遗传分化  62-63
参考文献  63-68
致谢  68-70
发表的学术论文  70

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