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过氧化氢酶对肠上皮细胞的保护机制的研究

作　者: 王群英
导　师: 张亚历；王继德
学　校: 第一军医大学
专　业: 内科学
关键词: 过氧化氢酶肠黏膜屏障 SW480细胞脂多糖凋亡致炎因子环氧合酶-2 细胞外信号调节激酶核转录因子-κB 大鼠
分类号: R574
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

肠上皮细胞是肠黏膜屏障组成中最重要的细胞成分,肠黏膜屏障遭到破坏时伴随着氧活性物质(ROS)的增加,ROS作为细胞内第二信使可以激活多种转录因子,调控致炎细胞因子和化学因子的过度表达,加重肠黏膜屏障功能的损坏。过氧化氢酶作为ROS的清除剂可以使过氧化氢分解为水和氧,减少肠黏膜内ROS的数量,减弱ROS的第二信使作用,从而起到保护肠黏膜的作用。我们在幽门螺杆菌(Helicobacter pylori,Hp)致病性的研究中,克隆纯化了该菌的过氧化氢酶(rHpCat,已申报专利),意外地发现在我们的表达系统中该酶的活性远高于目前普遍应用的购自Sigma公司的纯化牛肝过氧化氢酶。在本课题中,我们通过建立溃疡性结肠炎动物模型,从体内、体外实验系统评价商品化的过氧化氢酶和幽门螺杆菌过氧化氢酶对肠上皮细胞内细胞外信号调节激酶(ERK)、核转录因子κB(NF-κB)的激活、炎症介质和化学介质的释放、肠上皮细胞的凋亡等的作用。一、过氧化氢酶对LPS诱导SW480细胞应激反应的保护作用及机制研究应用肠癌细胞株SW480细胞,以脂多糖作为刺激因素,过氧化氢酶阳性克隆株在LB培养液(含100μg/ml氨苄青霉素)中37℃培养过夜,然后按1%转接至含氨苄青霉素的LB培养液中,继续培养至OD值为0.6～0.8,加IPTG至终浓度为0.1mmol/L,诱导表达3h,离心收集菌体,冷PBS洗2遍,按照菌体湿重与牛肝CAT的活性比,加入适当的PBS重悬,冰浴超声粉碎后,离心取上清进行实验。将对数生长期的细胞随机分为正常对照组、脂多糖(LPS)组、幽门螺杆菌过氧化氢酶(Hp-CAT)预孵组、幽门螺杆菌过氧化氢酶(Hp-CAT)处理组、牛肝过氧化氢酶(牛肝-CAT)预孵组、牛肝过氧化氢酶(牛肝-CAT)处理组。

全文目录

中文摘要  3-7
英文摘要  7-13
前言  13-16
第一部分  16-41
  引言  16
  1 材料与方法  16-28
    1.1 主要实验材料和试剂  16-20
    1.2 主要仪器  20-21
    1.3 实验方法  21-28
    1.4 统计学处理  28
  2 结果  28-40
    2.1 流式细胞术检测细胞凋亡  28
    2.2 电镜观察细胞内线粒体和凋亡改变  28-31
    2.3 RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-8等致炎细胞因子mRNA的表达  31-33
    2.4 免疫细胞化学和Western blot检测细胞内COX-2的蛋白表达  33-35
    2.5 免疫细胞化学检测NF-κB在SW480细胞内表达，Western-blot检测胞质内IκB的蛋白表达，EMSA检测NF-κB的激活  35-37
    2.6 激光共聚焦显微镜观察ERK在SW480细胞核内外的分布，Western-blot分析细胞内磷酸化ERK的蛋白表达  37-40
  小结  40-41
第二部分  41-56
  引言  41
  1 材料与方法  41-45
    1.1 主要试剂及配制  41
    1.2 主要仪器  41
    1.3 实验方法  41-45
    1.4 统计学处理  45
  2 结果  45-54
    2.1 大鼠粪便性状观察及结肠大体观察  45
    2.2 组织学观察  45-46
    2.3 扫描电镜观察  46-47
    2.4 细胞凋亡检测  47-49
    2.5 RT-PCR检测TNF-α、IL-1β、IL-8等致炎细胞因子mRNA的表达  49-50
    2.6 免疫组织化学和Western blot检测肠上皮细胞内COX-2的蛋白表达  50-52
    2.7 免疫细胞化学检测NF-κB在肠上皮细胞内表达，Western-blot检测胞质内IκB的蛋白表达，EMSA检测NF-κB的激活  52-54
  小结  54-56
第三部分  56-63
参考文献  63-78
附录  78-80
成果  80-81
致谢  81-82
原创性说明  82
学位论文版权使用授权书  82

过氧化氢酶对肠上皮细胞的保护机制的研究

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