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RNA干扰抑制HepG-2细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性影响的实验研究

作　者: 王春刚
导　师: 田建明
学　校: 第二军医大学
专　业: 影像医学与核医学
关键词: RNA干扰 DNA-PKcs 放射敏感性肿瘤:DSB
分类号: R73-36
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
下　载: 169次
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内容摘要

放射治疗是肿瘤治疗的基本方案之一,大约70%的肿瘤患者需要接受放射治疗。理论上,足够大的放射剂量能够杀死所有肿瘤细胞,但周围正常组织的放射损伤常常限制剂量增加。细胞DNA是电离辐射的主要靶点,后者通过直接和间接作用导致DNA链断裂,其中DSB是致死性的。真核细胞修复DSB的主要途径是NHEJ和HRR两种机制。哺乳动物体细胞主要修复方式是NHEJ,其中涉及DNA-PKcs,Ku,DNA ligase Ⅳ,XRCC4等蛋白以及一系列尚未发现的因子。 DNA-PK是NHEJ最重要的功能蛋白。作为丝/苏氨酸蛋白激酶,它由DNA-PKcs及Ku组成。Ku募集DNA-PKcs到DNA末端,形成DNA-PK全酶。激活的DNA-PK磷酸化一系列DNA结合蛋白,启动断端连接反应。 DSB修复缺陷的细胞对射线敏感性增加以及对射线耐受的细胞DSB修复蛋白高表达等现象从正反方面说明DSB修复与放射敏感性具有相关性,因此,抑制修复基因表达成为放射增敏的基本策略之一。诸多实验结果表明,通过抑制DNA-PKcs的表达可以阻断DSB修复,从而提高细胞的放射敏感性。 RNA干扰是利用与目的mRNA具有同源性的siRNA诱发序列特异性的转录后基因沉默的现象,它产生类似于“基因敲除”的生物表型,能够高效、特异地抑制靶基因,具有投入少、周期短、操作简单等优点。本课题在前人研究的基础上,构建细胞稳定表达siRNA的实验技术平台,在mRNA、蛋白质水平观察其对人肝癌细胞株HepG-2 DNA双链断裂修复基因DNA-PKcs表达的抑制作用,并在细胞水平观察其放射敏感性的影响,从而探讨稳定表达siRNA抑制DNA-PKcs基因表达对HepG-2细胞放射敏感性的影响,为肿瘤的放射增敏研究提供一条新的思路,同时进一步探讨DSB修复的作用机制。本课题选择人肝癌细胞株HepG-2 DSB修复基因DNA-PKcs作为靶基因,根据文献中证实针对DNA-PKcs基因有效的siRNA,合成63-64nt的寡核苷酸,经过退火与经BamH Ⅰ和HindⅢ酶切的线性化质粒pSilencer2.1-U6定向连接,转化大肠杆菌DH5α。连接成功的质粒分别命名为pSilencer-1、pSilencer-2。另以AMBION公司的错乱序列作为阴性对照,命名为pSilencer-C。这些质粒均经过PCR和测序鉴定。

全文目录

中文摘要  6-9
英文摘要  9-12
前言  12-16
第一部分  16-33
  材料  19-20
  方法  20-27
  结果  27-31
  讨论  31-33
第二部分  33-52
  材料  34-37
  方法  37-44
  结果  44-49
  讨论  49-52
第三部分  52-62
  材料  53-54
  方法  54-56
  结果  56-59
  讨论  59-62
总结  62-64
参考文献  64-73
综述  73-94
在校期间发表论文  94-95
致谢  95

RNA干扰抑制HepG-2细胞DNA-PKcs基因表达对放射敏感性影响的实验研究

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