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新疆加工番茄抗黄瓜花叶病毒转基因技术的研究

作　者: 张瑜
导　师: 向本春；郑银英
学　校: 石河子大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 黄瓜花叶病毒 系统进化树 RNA干扰
分类号: Q943.2
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
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内容摘要


黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus,CMV)是典型的+ssRNA病毒,是寄主最多、分布最广、对经济作物危害最为严重的植物病毒之一。该病毒为三分体病毒,基因组分布在3条RNA分子上,同时也是研究RNA病毒在寄主上致病机制的模式病毒之一。黄瓜花叶病毒是造成新疆加工番茄减产甚至绝产的重要病原,对于传统的抗病毒育种以及农药防治等方法不仅造成了环境污染,而且费时费力。但是RNAi技术拥有与传统的基因研究方法所不具备的优势,它为研究基因功能及植物基因表达调控提供了新途径,可通过有选择地抑制外源基因的表达,因此在病毒和病虫的防治方面展现了其独特之处。本研究采用RT-PCR的方法扩增黄瓜花叶病毒加工番茄NS04分离物的3个基因组部分序列,利用基因系统进化树分析发现基因组编码的四个蛋白：CMV-1a与日本的毒源AB179764同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为96.0%和98.6%:CMV-2a与中国浙江的DQ412731同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为98.0%和96.5%；CMV-2b与S72187同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为95.5%和90.1%；CMV-CP与中国浙江的EF312025同源性最高,核苷酸和氨基酸同源性分别为93.7%和98.1%。这一结果证明了黄瓜花叶病毒极易发生变异,可以快速适应新的寄主和环境,从而造成其株系分化十分复杂这一结论。最终选取CMV RAN2基因组中的复制酶片段作为靶序列,合成正反两段特异性片段并成功构建了pBi35SCR2RNAi真核表达载体,载体通过农杆菌介导的方法转入烟草,获得的转基因烟草做为后续攻毒实验的材料,并为研究植物抗黄瓜花叶病毒奠定了基础。

全文目录


摘要  5-6
Abstract  6-9
中英符号缩略词表  9-10
前言  10-11
第一章 文献综述  11-23
  1.1 黄瓜花叶病毒的研究状况  11-14
    1.1.1 黄瓜花叶病毒的危害性  11
    1.1.2 黄瓜花叶病毒的粒子特征  11-12
    1.1.3 黄瓜花叶病毒基因组结构  12
    1.1.4 黄瓜花叶病毒的株系划分  12-13
    1.1.5 CMV的致病性决定基因  13-14
  1.2 基因工程技术在抗黄瓜花叶病毒方面的研究  14-16
    1.2.1 病毒外壳蛋白基因及其应用  14
    1.2.2 病毒复制酶基因及其应用  14
    1.2.3 病毒卫星RNA的利用  14-15
    1.2.4 反义RNA介导的抗病毒特性  15
    1.2.5 缺陷型运动蛋白介导的抗病毒  15-16
    1.2.6 运用植物细胞工程技术结合理化诱变因子诱变筛选抗CMV突变体  16
  1.3 RNAi技术在防治病毒病害中的应用  16-23
    1.3.1 RNAi的研究历史  16
    1.3.2 RNA i技术原理  16-18
    1.3.3 递送dsRNA的实验技术  18-19
    1.3.4 RNAi特点  19-20
    1.3.5 RNAi的应用  20-23
第二章 新疆加工番茄黄瓜花叶病毒基因组分析  23-35
  2.1 材料  23-24
    2.1.1 毒源  23
    2.1.2 载体  23
    2.1.3 酶及试剂  23
    2.1.4 引物  23-24
    2.1.5 实验仪器  24
  2.2 实验方法  24-27
    2.2.1 毒源的采集  24
    2.2.2 毒源的分离  24
    2.2.3 病毒分离物NSO4的基因组序列分析  24-27
  2.3 结果与分析  27-35
    2.3.1 CMV基因组的RT-PCR扩增  27-28
    2.3.2 CMV基因组的测序  28
    2.3.3 编码四种CMV蛋白的核苷酸序列分析  28-35
第三章 抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建及烟草的转化  35-43
  3.1 材料  35
    3.1.1 载体和试剂  35
    3.1.2 植物  35
    3.1.3 引物  35
  3.2 方法  35-40
    3.2.1 抗黄瓜花叶病毒RNAi载体的构建  35-38
    3.2.2 根癌农杆菌介导pBI35CR2RNAi表达载体在烟草中的遗传转化  38-39
    3.2.3 RNAi转化烟草苗的抗性鉴定  39-40
  3.3 结果  40-43
    3.3.1 RNAi靶向基因靶序列的PCR扩增  40
    3.3.2 pBi35SCR2RNAi表达载体的构建及鉴定  40-41
    3.3.3 pBi35SCR2转化农杆菌GV3101  41-42
    3.3.4 转基因烟草植株的获得  42-43
第四章 讨论  43-44
  4.1 新疆加工番茄黄瓜花叶病毒分离物NSO4基因组分析  43
  4.2 抗CMV RNAi载体的构建及烟草的转化  43-44
参考文献  44-48
附录  48-53
致谢  53-54
作者简介  54-55
导师评定表  55

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中图分类: > 生物科学 > 植物学 > 植物细胞遗传学 > 植物基因工程
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