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玉米和黑麦草漆酶基因的克隆和系统发育分析及玉米水分胁迫下基因表达研究

作　者: 路运才
导　师: 王天宇；黎裕
学　校: 中国农业科学院
专　业: 作物遗传育种
关键词: 玉米漆酶黑麦草分子进化基因克隆 cDNA-AFLP 水分胁迫基因表达
分类号: S513
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

目前,玉米已经成为超过小麦的第二大粮饲兼用作物。消化率和干旱是影响玉米饲用品质和产量的两个重要因素。常规育种在饲用品质改良和抗旱育种中发挥了重要作用,但该途径费时费力,效率不高。生物技术的迅猛发展,为在分子水平上开展玉米饲用品质改良和抗旱性分子机制研究提供了有利契机。本研究利用基因同源序列克隆技术、cDNA-AFLP技术和生物信息学技术,一方面,进行黑麦草和玉米漆酶基因的克隆与分析;另一方面,对水分胁迫条件下4个玉米自交系材料的基因表达情况进行深入研究,确定与玉米抗旱相关的功能基因,从而为遗传工程改良饲料作物的消化率和增强玉米种质的抗旱性提供重要的物质基础和理论依据。这对于我国农业种植结构调整和畜牧业的发展以及实施高效节水农业均具有一定的理论和实践意义。本研究通过对参与木质素合成途径中一个重要酶-漆酶的系统分析与克隆以及利用cDNA-AFLP技术对不同抗旱性的玉米种质在水分胁迫条件下的基因表达规律进行了研究,获得了以下主要结果: 1.以64个不同来源的植物漆酶为材料,对其氨基酸序列进行了比较分析,并进行了分子进化机制的探讨。发现漆酶作为蓝铜氧化酶蛋白家族的成员,具有一个或数个不等的保守区域(HWHG和HLHG)及N糖基化结合位点。系统发生关系表明,植物漆酶是一个高度趋异的多基因家族,在种子植物分化为被子植物和裸子植物的前后,均可能发生了基因复制; 2.进一步通过对64个漆酶的一系列特征进行分析发现:同一物种的不同漆酶成员在序列上差异很大;在单子叶和双子叶植物中均有细胞外和细胞内漆酶蛋白;糖基化位点数目(8-23个)和等电点值的变化范围都很大(5-10);漆酶的催化底物广泛;在不同组织中差异表达。因此,植物漆酶除了参与木质素的生物合成外,还可能具有其它功能; 3.在27个水稻漆酶基因中,有9个位于第9号染色体上,6个位于第11号染色体上。这就意味着超过一半的漆酶成员集中在2条染色体上。水稻第1号染色体上的漆酶基因分散在3个不同的区段。从GRLC26到GRLC1跨越了21Mb。GRLC26位于区段1(15371897-15374072 bp);GRLC6位于区段2(25214631-25216628 bp)。区段3为GRLC5和GRLC1之间(1.3Mb),该区域位于C126435和C15960标记之间。位于第11号染色体上的漆酶基因。聚集于3个区段。其中,GRLC8、GRLC11、GRLC12、GRLC15位于短臂末端。我们发现GRLC11、GRLC12和GRLC15与水稻的一个MYB转录因子的基因克隆在染色体上的位置相近。17个拟南芥漆酶基因只有AtLC1和AtLC7分布于第1、4号染色体,其余则密集分布于第2、5号染色体。依据已经发表的拟南芥基因组部分复制区域,我们发现在第3号染色体的AtLC7和第5号染色体的AtLC8、AtLC9、AtLC10、AtLC11和AtLC12之间发生了基因复制; 4.拟南芥16个漆酶基因的数字化Northern分析结果显示,多数基因在根和茎组织强烈表

全文目录

第一章引言  12-45
  1 木质素和植物漆酶的研究进展  12-24
    1.1.青贮、青饲作物的消化率  12-13
    1.2.木质素研究进展  13-17
    1.3.植物漆酶及漆酶基因的研究进展  17-24
  2 植物抗旱性的研究进展  24-32
    2.1 玉米抗旱性的形态学及生理生化机制研究进展  24-27
    2.2 植物抗旱性的分子机制  27-29
    2.3 抗旱玉米种质的鉴定与改良  29-32
  3 基于基因差异表达的转录图谱研究进展  32-38
    3.1 差异表达基因的直接分析  32-35
    3.2 差异表达基因的间接分析  35-36
    3.3 玉米基因表达谱的研究进展  36-38
  4 生物信息学  38-41
    4.1 生物信息学数据库  38-39
    4.2 生物信息学在植物研究中的应用  39-41
  5 分子系统发育的研究进展  41-44
    5.1 系统发育树  41
    5.2 系统发育树构建方法  41-42
    5.3 系统发育分析软件包  42
    5.4 系统进化树的构建  42-43
    5.5 系统发育研究  43-44
  6 研究目的与意义  44-45
第二章基于生物信息学的植物漆酶的比较分析  45-57
  1 材料与方法  45-48
    1.1 漆酶氨基酸序列提取  45
    1.2 序列比对和系统发育树的构建  45
    1.3 信号肽和亚细胞位置预测  45
    1.4 拟南芥漆酶基因的组织特异性表达  45
    1.5 拟南芥与水稻漆酶基因在染色体上的位置  45-48
  2 结果与分析  48-56
    2.1 植物漆酶的结构特征  48
    2.2 植物漆酶的系统发生关系  48-52
    2.3 拟南芥与水稻漆酶基因在染色体上的位置  52-54
    2.4 拟南芥漆酶基因功能注释及组织特异性表达  54-56
  3 小结  56-57
第三章多年生黑麦草漆酶基因的克隆与分析  57-71
  1 材料与方法  57-64
    1.1 实验材料  57
    1.2 实验方法  57-64
      1.2.1 基因组DNA提取  57-58
      1.2.2 引物  58-59
      1.2.3 基因组PCR扩增  59
      1.2.4 PCR产物的纯化和琼脂糖胶回收  59-60
      1.2.5 PCR产物的连接  60-61
      1.2.6 PCR连接产物的转化  61
      1.2.7 菌液PCR  61-62
      1.2.8 质粒DNA的提取  62
      1.2.9 测序PCR反应体系及反应程序  62-64
      1.2.10 序列分析  64
  2 结果与分析  64-69
    2.1 基因组DNA的质量与浓度检测结果  64-65
    2.2 退火温度优化  65-66
    2.3 漆酶目的片段的扩增与纯化  66
    2.4 黑麦草漆酶基因的克隆与序列分析  66-69
  3 小结  69-71
第四章玉米漆酶基因的克隆、定位及特征分析  71-91
  1 材料与方法  71-76
    1.1 材料  71
    1.2 方法  71-76
      1.2.1 DNA提取  71-72
      1.2.2 基因组PCR所用引物  72-73
      1.2.3 基因组PCR反应及漆酶基因定位  73-74
      1.2.4 PCR产物的纯化和琼脂糖胶回收  74-75
      1.2.5 PCR产物的连接和转化  75
      1.2.6 质粒DNA的提取及测序  75
      1.2.7 序列分析与分析进化分析  75
      1.2.8 漆酶基因的染色体定位  75-76
  2 结果与分析  76-90
    2.1 基因组DNA检测结果  76
    2.2 退火温度优化  76-77
    2.3 漆酶目的片段的扩增与纯化  77
    2.4 质粒DNA的提取、纯化与酶切鉴定  77-79
    2.5 玉米漆酶基因序列分析  79
    2.6 植物漆酶基因同源比较及分子进化分析  79-88
    2.7 玉米漆酶基因的染色体初步定位  88-90
  3 小结  90-91
第五章利用cDNA-AFLP技术研究玉米水分胁迫诱导基因的表达  91-111
  1 材料与方法  91-98
    1.1 材料  91
    1.2 方法  91-98
      1.2.1 PEG胁迫溶液的配制  91-93
      1.2.2 总RNA的提取与检测  93
      1.2.3 双链cDNA的合成  93-95
      1.2.4 cDNA-AFLP分析  95-96
      1.2.5 电泳分离与银染  96
      1.2.6 聚丙烯酰胺胶中差异片段的回收  96-98
      1.2.7 PCR产物的纯化  98
      1.2.8 序列测定与分析  98
  2 结果与分析  98-110
    2.1 总RNA的浓度、纯度与质量鉴定  98-99
    2.2 双链cDNA的合成  99
    2.3 cDNA-AFLP分析  99-110
  3 小结  110-111
第六章结论  111-113
附录  113-121
参考文献  121-138
致谢  138-139
简历  139

玉米和黑麦草漆酶基因的克隆和系统发育分析及玉米水分胁迫下基因表达研究

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