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超嗜热菌Aquifex aeolicus亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用

作　者: 赵明炜
导　师: 王恩多
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亮氨酰-tRNA合成酶 tRNALeu 氨基酰化反应编校反应 CP1 结构域
分类号: Q936
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

亮氨酰-tRNA合成酶（Leucyl-tRNA synthetase, LeuRS）属于第一类氨基酰-tRNA 合成酶（aaRS）的a 亚类在蛋白质生物合成过程中它催化tRNA^Leu的亮氨酰化古老的超嗜热菌Aquifex aeolicus （A. aeolicus）的亮氨酰-tRNA合成酶（αβ-LeuRS）是目前唯一已知的双亚基亮氨酰-tRNA 合成酶大肠杆菌（E. coli）的亮氨酰-tRNA 合成酶则是单亚基酶在克隆了αβ-LeuRS 的α和β亚基的基因以及与之相对应的编码E. coli LeuRS α’和β’亚基的基因片段的基础上通过对应基因片段的不同排列和重组得到了10种来源于大肠杆菌和超嗜热菌的重组LeuRS 基因成功地表达了它们并纯化了其中7 种重组酶通过对重组酶的性质研究发现αβ-LeuRS 的α亚基C 末端36 个氨基酸对于αβ-LeuRS 的氨基酰化活力至关重要αβ-LeuRS 的两个亚基人为融合得到的单亚基酶SLeuRSαβ具有完全的野生型双亚基酶活力它的热稳定性显著增强同时通过亚基重组揭示了LeuRS 对于不同种属的tRNALeu的识别元件位于α亚基内

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目录  2-8
摘要超嗜热菌Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶和tRNALeu的相互作用  8-11
ABSTRACT The interaction between Aquifex aeolicus leucyl-tRNA synthetase and tRNALeu  11-15
第一部分亮氨酰-tRNA 合成酶亚基功能与结构基础关系的研究  15-78
  第一章来源于大肠杆菌和超嗜热菌重组亮氨酰-tRNA合成酶的性质研究  15-45
    摘要  15
    关键词  15-16
    1. 引言  16-19
    2. 材料与方法  19-27
      2.1 材料  19-20
      2.2 质粒  20
      2.3 DNA 片段扩增以及含有LeuRS 突变基因的质粒的构建  20-23
      2.4 重组LeuRS 基因的表达以及重组LeuRS 的纯化  23-24
      2.5 圆二色性(CD)光谱的测定  24
      2.6 重组LeuRS 氨基酸活化反应动力学常数的测定  24-25
      2.7 重组LeuRS 氨基酰化反应动力学常数的测定  25-26
      2.8 SLeuRSαβ亮氨酰化活性位点滴定  26
      2.9 SLeuRSαβ最适反应温度以及热稳定性测定  26-27
    3. 结果  27-37
      3.1 重组质粒的构建酶基因的表达与酶的纯化  27-28
      3.2 LeuRS 突变酶CD 光谱测定结果  28-29
      3.3 LeuRS 突变酶活力变化  29-31
      3.4 SLeuRSαβ变种只有一个氨基酰化活性位点  31-32
      3.5 SLeuRSαβ突变酶稳态动力学性质  32-35
      3.6 SLeuRSαβ突变酶活力温度关系以及热稳定性  35-37
    4. 讨论  37-42
    参考文献  42-45
  第二章亮氨酰-tRNA 合成酶 CP1 结构域对于种属间tRNALeu的识别至关重要  45-78
    摘要  45-46
    关键词  46
    1. 引言  46-51
    2. 材料和方法  51-57
      2.1 材料  51
      2.2 DNA 片段的扩增以及含有LeuRS 突变基因的质粒的构建  51-53
      2.3 LeuRS 突变酶基因的表达以及LeuRS 嵌合酶的纯化  53
      2.4 圆二色性(CD) 光谱的测定  53-54
      2.5 LeuRS 嵌合酶氨基酸活化反应活力及动力学常数测定  54
      2.6 LeuRS 嵌合酶的氨基酰化反应活力及动力学常数的测定  54
      2.7 LeuRS 嵌合酶误氨基酰化反应的测定  54-55
      2.8 LeuRS 嵌合酶编校反应ATP 消耗的测定  55
      2.9 同位素标记的误氨基酰化产物的制备和去氨基酰化  55-57
    3. 结果  57-67
      3.1 重组质粒的构建酶基因的表达与酶的纯化  57-59
      3.2 LeuRS 嵌合酶CD 光谱测定结果(51)  59
      3.3 LeuRS 嵌合酶活力变化  59-60
      3.4 LeuRS 嵌合酶对对应氨基酸和非对应氨基酸的识别  60-61
      3.5 嵌合酶氨基酰化反应稳态动力学性质  61-63
      3.6 LeuRS 嵌合酶误氨基酰化反应  63-64
      3.7 LeuRS 嵌合酶编校反应ATP 消耗  64-66
      3.8 LeuRS 嵌合酶对误氨基酰化产物的编校  66-67
    4. 讨论  67-73
    参考文献  73-78
第二部分超嗜热菌亮氨酰-tRNA 合成酶编校功能的研究  78-156
  第三章超嗜热菌亮氨酰-tRNA 合成酶编校功能的研究  78-109
    摘要  78
    关键词  78-79
    1. 引言  79-84
    2. 材料和方法  84-88
      2.1 材料  84-85
      2.2 LeuRS 突变体基因的构建表达以及突变体LeuRS 的纯化  85-86
      2.3 圆二色性(CD) 光谱的测定  86
      2.4 LeuRS 突变酶的氨基酸活化反应动力学常数测定  86
      2.5 LeuRS 突变酶氨基酰化反应活力及动力学常数的测定  86-87
      2.6 LeuRS 突变酶误氨基酰化反应的测定  87
      2.7 LeuRS 突变酶编校反应ATP 消耗的测定  87
      2.8 LeuRS 突变酶体内补偿实验  87-88
    3. 结果  88-100
      3.1 LeuRS 突变位点的选择与构建  88-89
      3.2 LeuRS 突变酶基因的表达与酶的纯化  89-90
      3.3 LeuRS 突变酶CD 光谱测定结果  90
      3.4 LeuRS 突变酶的活力变化  90-92
      3.5 LeuRS 突变酶对对应和非对应氨基酸的识别  92-93
      3.6 LeuRS 突变酶的氨基酰化反应稳态动力学性质  93-94
      3.7 LeuRS 突变酶误氨基酰化反应  94-96
      3.8 LeuRS 突变酶编校反应ATP 消耗  96-97
      3.9 不同LeuRS 突变酶对温度敏感菌株KL231 的拯救  97-100
    4. 讨论  100-104
    参考文献  104-109
  第四章超嗜热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶CP1 结构域独立行使编校功能  109-156
    摘要  109
    关键词  109-110
    1. 引言  110-115
    2. 材料和方法  115-121
      2.1 材料  115-116
      2.2 DNA 片段扩增以及含有不同CP1 基因的质粒的构建  116-117
      2.3 CP1 基因的表达以及不同CP1 结构域的纯化  117-118
      2.4 圆二色性(CD) 光谱的测定  118-119
      2.5 RNA 转录产物的制备  119-120
      2.6 同位素标记的误氨基酰化产物的制备  120-121
      2.7 CP1 结构域的编校功能及动力学常数的测定  121
    3. 结果  121-140
      3.1 不同CP1 结构域以及突变体的设计和构建  121-125
      3.2 重组质粒的构建 CP1 基因的表达与CP1 结构域的纯化  125-126
      3.3 CP1 结构域及突变体CD 光谱测定结果  126-127
      3.4 同位素标记的误氨基酰化产物  127-128
      3.5 只有Aa-CP1 能够对Ile-tRNALeu行使编校功能  128-130
      3.6 A.a eolicus LeuRS 的β亚基能够赋予独立的E. coli CP1 结构域编校功能  130-133
      3.7 Aa-CP1 中20-aa 模体对于CP1 结构域编校Ile-tRNA~(Leu)至关重要  133-136
      3.8 细菌来源的CP1 结构域均能编校Ile-minihelix~(Leu)  136-138
      3.9 20-aa 模体增强CP1 对小螺旋的编校能力  138-140
    4. 讨论  140-148
    参考文献  148-156
结论  156-159
附录本论文缩写汇编  159-162
在学期间论文发表会议报告和获奖目录  162-165
致谢  165

超嗜热菌Aquifex aeolicus亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用

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