学位论文 > 优秀研究生学位论文题录展示

亮氨酰tRNA合成酶作为抗肿瘤的潜在靶点

作　者: 姚璎
导　师: 李大伟
学　校: 上海交通大学
专　业: 微生物与生化药学
关键词: 抗肿瘤靶点抗肿瘤药物亮氨酰tRNA合成酶抑制剂细胞周期调亡移植瘤
分类号: R73-3
类　型: 硕士论文
年　份: 2010年
下　载: 50次
引　用: 0次
阅　读: 论文下载

内容摘要

由于肿瘤类型的复杂性和多样性以及肿瘤对单一靶点药物的抗药性,目前化疗药物所针对的靶点远远不能满足肿瘤治疗的需要,因而急待开发针对新型抗肿瘤药物的靶点。我们在研究抗锥虫亮氨酰tRNA合成酶(tbLeuRS)抑制剂对人源细胞毒性的过程中,发现有些抑制剂对人源亮氨酰tRNA合成酶(hLeuRS, LARS)有明显抑制,并可以抑制人的肿瘤细胞生长。由此我们提出:人源亮氨酰tRNA合成酶作为抗肿瘤药物的新靶点是可能的,而针对人源亮氨酰tRNA合成酶的抑制剂也有可能成为新型抗肿瘤药物。本课题试图在分子、细胞和动物水平验证亮氨酰tRNA合成酶成为抗肿瘤靶点的可能性,并对抑制这一靶点的抗肿瘤分子机制作出初步推断。研究结果表明,由于结构的相似性,部分根据锥虫亮氨酰tRNA合成酶模拟设计的抑制物可以抑制人的亮氨酰tRNA合成酶(hLeuRS),并由此抑制人源细胞的增殖。亮氨酰tRNA合成酶抑制物(hLRSI)对抑制肿瘤细胞增殖有一定的选择性而这种选择性可能是由于肿瘤细胞在一定条件下比非肿瘤细胞增殖速度快造成的。与抑制蛋白合成的放线菌酮作用机制不同,hLRSI可能通过激活依赖p53的p21信号传导通道促进细胞早期凋亡,并使细胞周期阻断在G0/G1期。动物实验表明,hLRSI对移植瘤有一定的抑制作用,而对动物毒性较小。综上所述,我们初步证实了亮氨酰tRNA合成酶是一个抗肿瘤药物的潜在靶点。这为进一步研究并利用这一靶点设计、合成、筛选新型抗肿瘤药物打下了基础。

全文目录

摘要  3-5
Abstract  5-10
第一章绪论  10-29
  1.1 抗肿瘤药物基于靶点的分类  10-18
    1.1.1 肿瘤细胞特异性的靶点  10-11
    1.1.2 非特异性靶点  11-18
  1.2 氨基酸与肿瘤  18-22
    1.2.1 氨基酸不平衡法治疗肿瘤  18-19
    1.2.2 Leu 参加mTOR 信号转导途径  19-21
    1.2.3 Leu-mTOR 途径与肿瘤  21-22
  1.3 氨酰t-RNA 合成酶作为抗肿瘤的靶点  22-27
    1.3.1 氨酰t-RNA 合成酶的分类  22-24
    1.3.2 氨酰t-RNA 合成酶的功能  24-25
    1.3.3 氨酰t-RNA 合成酶作为潜在的抗肿瘤的靶点  25-26
    1.3.4 氨酰tRNA 合成酶作为抗肿瘤药物靶点的研究现状  26-27
  1.4 课题意义及研究内容  27-29
第二章人源性亮氨酰tRNA 合成酶的克隆、表达、纯化及活性测定  29-44
  2.1 导言  29
  2.2 材料及仪器  29-31
    2.2.1 质粒及菌株  29-30
    2.2.2 酶、主要试剂  30-31
    2.2.3 主要仪器  31
  2.3 实验方法  31-37
    2.3.1 DNA 的琼脂糖电泳  31
    2.3.2 PCR 产物割胶回收  31-32
    2.3.3 转化  32
    2.3.4 质粒抽提  32-33
    2.3.5 HOSE 细胞中提取总的RNA  33
    2.3.6 RNA 逆转录（Reverse Transcription， RT）  33-34
    2.3.7 PCR 扩增目的基因  34
    2.3.8 人源亮氨酰tRNA 合成酶表达质粒的构建  34
    2.3.9 重组菌的小量诱导  34-35
    2.3.10 重组蛋白的大量表达  35
    2.3.11 重组蛋白的纯化  35-36
    2.3.12 免疫印迹  36
    2.3.13 酶活性分析  36-37
  2.4 实验结果  37-42
    2.4.1 人源性亮氨酰tRNA 合成酶重组质粒构建原理  37-38
    2.4.2 重组表达质粒pET21a-hLeuRS-N/C-His 的构建  38-39
    2.4.3 融合蛋白的表达及纯化  39-40
    2.4.4 免疫印迹分析  40-41
    2.4.5 酶活性的测定  41-42
  2.5 讨论和小结  42-44
第三章亮氨酰-tRNA 合成酶抑制剂的筛选  44-55
  3.1 导言  44-45
  3.2 材料及仪器  45-46
    3.2.1 质粒和细胞  45
    3.2.2 主要试剂  45
    3.2.3 主要仪器  45-46
  3.3 实验方法  46-48
    3.3.1 同源序列比对  46
    3.3.2 酶学水平上抑制剂的筛选  46
    3.3.3 候选化合物对U2OS 细胞和SKOV3 细胞增殖抑制作用  46-47
    3.3.4 化合物No.1，No.32 对U2OS 细胞的生长抑制  47
    3.3.5 化合物No.32 对EMT6 和3T3 细胞的生长抑制  47-48
    3.3.6 数据处理  48
  3.4 实验结果  48-54
    3.4.1 体外小分子抑制剂选择的原理  48-49
    3.4.2 体外酶学水平对小分子抑制剂的筛选  49-50
    3.4.3 体外细胞水平对小分子抑制剂的筛选  50-51
    3.4.4 待选抑制剂的分类  51
    3.4.5 选定的小分子抑制剂可以抑制肿瘤细胞生长  51-52
    3.4.6 抑制剂对肿瘤细胞的生长抑制比正常细胞的生长抑制敏感  52-54
  3.5 讨论与小结  54-55
第四章亮氨酰tRNA 合成酶作为抑制剂在细胞内的靶点  55-66
  4.1 导言  55
  4.2 材料及仪器  55-56
    4.2.1 质粒和细胞  55-56
    4.2.2 主要试剂  56
    4.2.3 主要仪器  56
  4.3 实验方法  56-58
    4.3.1 亮氨酰tRNA 合成酶真核表达载体的构建  56-57
    4.3.2 细胞培养  57
    4.3.3 PEI 介导重组质粒转染  57
    4.3.4 质粒转染法进行靶点初步确定  57-58
    4.3.5 浓度梯度质粒转染进一步确定靶点  58
    4.3.6 免疫印迹  58
  4.4 实验结果  58-65
    4.4.1 亮氨酰tRNA 合成酶真核表达载体的构建  58-60
    4.4.2 建立靶点确认体系  60-63
    4.4.3 确认亮氨酰tRNA 合成酶作为抑制剂在细胞内作用的靶点  63-65
  4.5 讨论与小结  65-66
第五章亮氨酰tRNA 作为靶点的作用机制  66-80
  5.1 导言  66
  5.2 材料及仪器  66-67
    5.2.1 质粒和细胞  66-67
    5.2.2 主要试剂  67
    5.2.3 主要仪器  67
  5.3 实验方法  67-69
    5.3.1 细胞形态学观察  67
    5.3.2 DAPI 染色判断调亡差异  67-68
    5.3.3 流式细胞仪检测  68
    5.3.4 瞬时转染实验及荧光素酶报告基因的检测  68-69
    5.3.5 肿瘤移植实验  69
    5.3.6 数据处理  69
  5.4 实验结果  69-78
    5.4.1 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以诱导细胞凋亡  69-73
    5.4.2 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以使细胞周期停滞在G0/G1 期  73-74
    5.4.3 对亮氨酰tRNA 合成酶的抑制可以调控p21 启动子的转录活性  74-76
    5.4.4 对肿瘤生长的影响  76-77
    5.4.5 血清影响抑制剂对细胞的凋亡作用  77-78
  5.5 讨论和小结  78-80
第六章全文总结  80-81
参考文献  81-85
符号说明（附录1）  85-87
试剂配方（附录2）  87-92
  附录一：蛋白表达纯化过程中所用试剂  87-89
  附录二：免疫印迹试剂的配制  89-91
  附录三：细胞实验所用试剂  91-92
致谢  92-94
攻读硕士学位期间已发表的论文及申请专利  94-97
  已发表论文  94
  申请发明专利  94-97
上海交通大学硕士学位论文答辩决议书  97

亮氨酰tRNA合成酶作为抗肿瘤的潜在靶点

内容摘要

全文目录

相似论文