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大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶编校结构域和其与蛋氨酸和异亮氨酸复合物晶体结构的研究

作　者: 刘云清
导　师: 丁建平
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 结晶学 X-射线 晶体结构 氨基酰-tRNA合成酶 亮氨酰-tRNA合成酶 氨酰化反应 编校结构域 锁钥机理 识别
分类号: Q75
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要


氨基酰-tRNA合成酶（aaRS）通过氨酰化反应负责把氨基酸共价连接到其对应的tRNA上,这在维持蛋白质合成的保真度上起到重要作用。亮氨酰-tRNA合成酶不仅可以把共轭的亮氨酸而且可以把相近的异亮氨酸和蛋氨酸共价连接到tRNALeu。亮氨酰-tRNA合成酶的编校结构域能水解错配的Ile-tRNALeu和Met-tRNALeu。我们解析了大肠杆菌亮氨酰-tRNA合成酶编校结构域（ecLeuRS-ED）本身和其分别与蛋氨酸和异亮氨酸复合物的晶体结构。这些结构为ecLeuRS-ED编校功能的阐明提供了详尽分子基础的新视角。Met和Ile精确底物识别和结合的详细结构分析揭示了在编校活性位点上底物的结合和识别机制。编校活性位点由一系列参与精确识别和结合非共轭氨基酸的保守氨基酸位点组成。底物结合口袋有一个为异亮氨酸和蛋氨酸在立体化学上优化的而对亮氨酸有阻碍作用的刚性结构。基于我们测定的结构和之前已有的生化数据,我们提出ecLeuRS-ED采用了一种锁钥机制来识别和区分氨基酸。在编校反应中错配的氨基酸的水解依赖于对底物主链和支链的适当的结合和正确的识别。ecLeuRS-ED的编校活性位点有一个非常刚性的有很精确设计的立体化学性质的结构（锁）,采用一系列保守氨基酸残基来精确结合和识别错配的非共轭氨基酸而区分排斥正确的共轭氨基酸,具体就是采用Met336、Asp345,另外可能还有Thr247对底物主链进行识别,采用Thr252、Met336和Val338对支链进行识别。一个氨基酸底物（钥匙）可以适合到底物结合口袋中来,包括几何构象上的性质（尺寸和长度）,也包括化学上的性质,可以结合到口袋中,并形成合适的构象位置来完成水解反应。不适合进编校位点的氨基酸将会被排斥掉,因为它们要么太小以至于不能紧密结合在活性位点（比如Ala） ,要么和蛋白质上口袋中活性位点周围的氨基酸残基有立体化学位阻（比如Leu）。结构比较也揭示了氨基酰-tRNA合成酶Ia亚类共享一个保守的编校结构域的结构核心和编校活性位

全文目录


1. 引言  9-29
  1.1 X 射线晶体学方法测定生物大分子的三维结构  9-10
  1.2 氨基酰-tRNA 合成酶概况  10-17
  1.3 氨基酰-tRNA 合成酶Ia 亚家族概况  17
  1.4 氨基酰-tRNA 合成酶Ia 亚家族的晶体结构  17-21
  1.5 氨基酰-tRNA 合成酶的高度保真性要求  21-22
  1.6 底物的选择性“双筛选”模型  22-24
  1.7 转移前编校通路和转移后编校通路  24-29
2. 材料和方法  29-37
  2.1 材料和试剂  29-30
    2.1.1 常用试剂和材料  29
    2.1.2 菌株  29
    2.1.3 仪器  29-30
  2.2 方法  30-37
    2.2.1 克隆、表达载体和菌株构建  30
    2.2.2 ecLeuRS-ED基因的蛋白质表达、纯化和检测  30-31
    2.2.3 溶液中蛋白质质分子尺寸和聚集状态分析  31
    2.2.4 晶体生长-悬滴气相扩散法  31-32
    2.2.5 X-射线晶体衍射和数据处理  32
    2.2.6 结构解析  32-36
    2.2.7 ecLeuRS-ED-tRNA 复合物模型的构建  36-37
3. 结果  37-55
  3.1 一系列LeuRS 截短体和突变体的构建、表达、纯化和结晶  37-41
  3.2 ecLeuRS-ED 底物复合物共晶实验结果  41
  3.3 ecLeuRS-ED 的整体三维晶体结构  41-45
  3.4 包含Ala293 的肽段区域观察到较大构像变化  45-47
  3.5 包含 Ty1330 的肽段区域观察到较大构像变化  47-49
  3.6 ecLeuRS-ED 与底物Met 的复合物晶体结构  49-52
  3.7 ecLeuRS-ED 与底物Ile 的复合物晶体结构  52-55
4. 讨论  55-72
  4.1 包含 Ala293 和 Ty1330 的肽段区域可能在编校反应中参与tRNA结合  55-60
  4.2 氨基酸识别的锁钥机制  60-61
  4.3 底物主链构像锁定的机制  61
  4.4 底物支链特异性区分的机制  61-62
  4.5 催化进攻的可能机理  62-66
  4.6 ecLeuRS 底物编校机理总结  66-68
  4.7 氨基酰-tRNA 合成酶Ia 亚家族的编校结构域共有一个保守的结构  68-72
5. 结论  72-73
参考文献  73-81
附表  81-84
发表文章目录  84-85
致谢  85

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 分子遗传学
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