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亮氨酰-tRNA合成酶和tRNA～（Leu）的相互作用

作　者: 徐敏刚
导　师: 王恩多
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 亮氨酰-tRNA合成酶 tRNALeu 氨基酰化反应编校反应小螺旋
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 2004年
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内容摘要

亮氨酰-tRNA 合成酶(Leucyl-tRNA synthetase, LeuRS)属于第一类氨基酰-tRNA 合成酶的 a 亚类。在蛋白质生物合成过程中,它催化 tRNALeu 的亮氨酰化。为了保证生物合成的高度精确性,LeuRS 同时具有编校活性。为进一步研究大肠杆菌(Escherichia coli, E. coli)亮氨酰-tRNA合成酶的 CP1 结构域中 T252对大肠杆菌 LeuRS 编校功能的作用, T252 被突变为 G, D,和 E。变种酶的氨基酰化稳态动力学常数测定和编校反应实验表明 252 位氨基酸侧链大小的改变及其与周围基团间氢键的变动都会影响酶的编校能力。通过含有变种基因的温度敏感菌株 KL231 在不同温度的生长情况的进一步研究发现,含有编校活力缺陷的 LeuRS基因的转化子在亮氨酸类似物存在的情况下生长受抑制。近一步研究发现 LeuRS-T252E 在误氨基酰化过程中有效区分 E. colitRNALeu 和 tRNALeu 两种 tRNALeu 等受体,其中 tRNALeu 的误氨基酰化曲线为通 1 2 2常的随时间增加而逐步上升,而 tRNALeu 的误氨基酰化曲线在反应初始阶段出 1现最高值, 然后逐步下降。即在反应的早期可检测误氨基酰化 tRNALeu 的快速 1累积。对 tRNALeu第一对碱基配对的点突变研究证实该碱基对配对的稳定性差 - 1 -<WP=8>中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文徐敏刚摘要异决定了误氨基酰化曲线的不同。误氨基酰化-tRNALeu 从氨基酰化位点到编校 1中心的转位可能慢于误氨基酰化 tRNALeu ,导致误氨基酰化-tRNALeu 以相对慢 2 1的速率被编校活性中心水解,从而发生累积。tRNALeu 3’末端替换实验发现76A 突变为 U 的变种 tRNALeu 完全丧失激发 E. coli LeuRS 编校活性的能力,但 2保留了大部分的氨基酰化接受活性。同时 LeuRS 可能是目前已知的唯一一种可以氨基酰化 3’末端 76A缺失 tRNA的 aaRS。在一种古老的超耐热菌 Aquifex aeolicus 中, 亮氨酰-tRNA 合成酶(Leucyl-tRNA synthetase, LeuRS)以异源双亚基形式存在,命名为αβ-LeuRS。其他已知的 LeuRS 都为单肽链形式。在我组已有工作的基础上,本节研究工作通过活性位点滴定证实αβ-LeuRS为单一活性位点。构建了 A. aeolicus tRNALeu的体外转录系统。发现在大肠杆菌表达系统中可以单独高表达的β亚基可以结合tRNALeu, 竞争实验表明该结合可能为非特异性结合,存在两种结合形式β-tRNA 和β-(tRNA)2。但氨基酰化测定和 ATP 结合实验证明单独的β无催化活性。半数以上的氨基酰-tRNA 合成酶体系可以氨基酰化模拟 tRNA 接受茎和TΨC 茎环结构的小螺旋(minihelix) 结构域。但大肠杆菌和人细胞质亮氨酰-tRNA 合成酶(Leucyl-tRNA synthetase, LeuRS)无法氨基酰化小螺旋或更小的微螺旋。在本实验中, 我们首次报道目前已知的唯一双亚基 LeuRS, Aquifexaeolicus LeuRS (αβ-LeuRS)可以亮氨酰化小螺旋。该反应严格依赖于小螺旋中 - 2 -<WP=9>中国科学院生物化学与细胞生物学研究所博士论文徐敏刚摘要A73 位亮氨酸同一性(identity)元件的存在,它的第一对碱基对的去稳定化极大地提高氨基酰化反应速度。在反应中加入 A. aeolicus tRNALeu的反密码子茎环可以加强αβ-LeuRS 氨基酰化小螺旋的反应。该结果表明αβ-LeuRS 不同结构域间可能存在着通讯机制。αβ-LeuRS 独特的亮氨酸专一性结构域可能参与了对小螺旋的识别。为了保证在遗传密码翻译过程中的精确性,LeuRS 往往以tRNALeu 依赖的形式水解误活化的氨基酸(转移前编校)和误氨基酰化-tRNA(转移后编校)。与完整的 tRNALeu不同,即使在反应中加入游离的 tRNA反密码子茎环结构,小螺旋结构域也无法诱导转移后编校。所以,tRNALeu 的整体结构对于αβ-LeuRS 编校反应是至关重要的。但研究发现,小螺旋结构并不因此而被误氨基酰化,其可能是由于αβ-LeuRS 具有一种非 tRNA 依赖的转移前编校活性。

全文目录

目录  2-7
摘要:亮氨酰-tRNA合成酶和tRNALeu的相互作用  7-10
ABSTRACT:The interaction between leucyl-tRNAsynthetase and tRNALeu  10-13
第一部分大肠杆菌亮氨酰-tRNA 合成酶的研究  13-62
  第一章大肠杆菌亮氨酰-tRNA 合成酶 T252 上的侧链基团对氨基酸底物的识别及细胞生存是重要的  13-39
    摘要  13
    关键词  13-14
    1 引言  14-18
    2 材料与方法  18-23
      2.1 材料  19
      2.2 突变体 LeuRS 基因的构建，表达和纯化  19-20
      2.3 氨酰化测定  20-21
      2.4 编校反应中 ATP 消耗的测定  21-22
      2.5 同位素标记的氨基酰化产物的制备和去氨基酰化  22
      2.6 大肠杆菌 LeuRS 和突变体体内的补偿实验  22-23
      2.7 生长曲线测定  23
      2.8 测定高浓度外源 a-氨基丁酸(Abu)对 KL231 转化子的影响  23
    3 结果  23-32
      3.1 酶基因的表达与酶的纯化  23-24
      3.2 LeuRS 变种酶活力变化及稳态动力学常数  24-25
      3.3 T252 替换对 E. coli LeuRS 编校活力的影响  25-29
      3.4 大肠杆菌 LeuRS 和突变体酶对 KL231 的拯救  29-31
      3.5 α-氨基丁酸(Abu)对细胞的毒性实验  31-32
    4 讨论  32-36
    参考文献  36-39
  第二章 tRNALeu 接受茎末端变动对大肠杆菌亮氨酰-tRNA 合成酶的亮氨酰化和编校活性的影响  39-62
    摘要  39-40
    关键词  40
    1 引言  40-43
    2 材料和方法  43-45
      2.1 材料  43
      2.2 RNA 底物制备  43-44
      2.3 氨基酰化测定  44-45
      2.4 编校反应中的 ATP 消耗的测定  45
    3 结果  45-55
      3.1 RNA 底物设计和构建  45-46
      3.2 tRNALeu 接受茎末端去稳定化对 E. coli LeuRS 氨基酰化和编校反应的影响  46-52
      3.3 E. coli tRNALeu 3' 末端变动对氨基酰化和编校功能的影响  52-55
    4 讨论  55-59
    参考文献  59-62
第二部分超耐热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶的研究  62-119
  第三章超耐热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶与 tRNA 的相互作用  62-79
    摘要  62
    关键词  62-63
    1 引言  63-65
    2 材料和方法  65-69
      2.1 材料  65
      2.2 体外转录 A. aeolicus tRNALeu的制备  65-67
      2.3 A. aeolicus LeuRS 的β亚基结合核酸实验  67
      2.4 β亚基与 tRNA 间形成的复合物的分子量测定  67
      2.5 酶活性测定  67-68
      2.6 αβ-LeuRS 亮氨酰化活性位点滴定  68-69
    3 结果  69-73
      3.1 β亚基结合 tRNA  69-71
      3.2 HPLC 验证β亚基:tRNA 复合物的构成  71-72
      3.3 αβ-LeuRS 只有一个氨基酰化活性位点  72-73
    4 讨论  73-76
    参考文献  76-79
  第四章超耐热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶氨基酰化小螺旋(minihelices)的研究  79-119
    摘要  79-80
    关键词  80
    1 引言  80-84
    2 材料和方法  84-88
      2.1 材料  84-85
      2.2 RNA 底物制备  85-86
      2.3 RNA 熔点(Melting Temperature，Tm)的测定  86-87
      2.4 亮氨酰化和误氨基酰化反应的测定  87-88
      2.5 编校反应中 ATP 消耗的测定  88
    3 结果  88-105
      3.1 RNA 底物设计和构建  88-90
      3.2 古老的αβ-LeuRS 可以亮氨酰化小螺旋  90-92
      3.3 小螺旋第一对碱基对的去稳定化提高氨基酰化水平  92-94
      3.4 反应温度对小螺旋氨基酰化的影响  94-96
      3.5 小螺旋的氨基酰化依赖于 A73 位决定子  96-98
      3.6 其它 RNA 螺旋的加入对小螺旋氨基酰化的影响  98-100
      3.7 αβ-LeuRS 的亮氨酸专一性结构域可能参与了对小螺旋的识别  100-102
      3.8 不依赖 tRNA 的转移前编校阻止了小螺旋的误氨基酰化  102-105
    4 讨论  105-111
    参考文献  111-119
结论  119-121
附录:本论文缩写汇编  121-124
在学期间论文发表、会议报告、和获奖目录  124-126
致谢  126

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