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超嗜热菌亮氨酰-tRNA合成酶的高表达和一步纯化氨基酰-tRNA合成酶复合物结构和功能的研究

作　者: 凌晨
导　师: 王恩多
学　校: 中国科学院研究生院（上海生命科学研究院）
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 氨基酰-tRNA合成酶(aaRS) αβ-LeuRS argU 氨基酰-tRNA合成酶复合物亮氨酰-tRNA合成酶精氨酰-tRNA合成酶昆虫表达系统末端结构域 p43 p38 p18 Arc1p
分类号: Q78
类　型: 博士论文
年　份: 2006年
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内容摘要

超嗜热菌（Aquifex aeolicus）亮氨酰-tRNA合成酶,αβ-LeuRS,是已知唯一的杂合二体亮氨酰-tRNA合成酶。它包含α和β两个亚基,分子量分别是74.0KDa和33.5 KDa。编码α亚基的基因被克隆进入pSBET-b载体,并在其序列前添加编码6个组氨酸的寡核苷酸片段。pSBET-b载体含有编码稀有的大肠杆菌（Escherichia coli） tRNA^Arg （AGA/AGG）的argU基因,该基因有助于含有高频率AGA/AGG密码子的αβ-LeuRS在E. coli中大量表达。编码β亚基的基因被克隆进入pET-15b载体。两个重组质粒被共转化进入E. coli BL21-CodonPlus （DE3）菌株,进而表达基因产生αβ-LeuRS。该酶的α亚基N-端带有6个组氨酸,利用Ni-NTA亲和层析纯化,从250毫升培养基中得到7毫克纯化的αβ-LeuRS。N-端的组氨酸对酶的氨基酰化活力没有影响。人胞质亮氨酰-tRNA合成酶（hcLeuRS）是一个多合成酶复合物（aaRS复合物）的组成成分,这与以游离形式存在的原核和低等真核生物的亮氨酰-tRNA合成酶（LeuRS）有显著不同。在本实验室已经纯化了hcLeuRS的基础上,本

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摘要:  2-4
ABSTRACT:  4-11
第一部分超嗜热菌 Aquifex aeolicus 亮氨酰-tRNA 合成酶的高表达和纯化  11-24
  摘要  11
  关键词  11
  1. 引言  11-14
  2. 材料和方法  14-18
    2.1. 试剂,菌株和质粒  14
    2.2. 质粒pSBETH6-lrsa 和pET-15B-lrsb 的构建  14-16
    2.3. His6-αβ-LeuRS 基因的表达  16
    2.4. His6-αβ-LeuRS 的纯化  16-17
    2.5. 酶活性和动力学常数的测定  17-18
  3. 结果和讨论  18-21
    3.1 得到重组质粒pSBETH6-lrsa 和pET-15b-lrsb  18
    3.2. His6-αβ-LeuRS 的基因表达和蛋白质纯化  18-20
    3.3. His6-αβ-LeuRS 的氨基酰化活力和动力学常数  20-21
  4. 参考文献  21-24
第二部分氨基酰-tRNA 合成酶复合物结构和功能的研究  24-94
  第一章复合物中亮氨酰-tRNA 合成酶的 C-末端延伸肽段与精氨酰-tRNA 合成酶相互作用  24-66
    摘要  24
    关键词  24-25
    1. 引言  25-28
    2. 材料和方法  28-42
      2.1. 试剂,质粒,菌株和细胞株  28-30
      2.2. ΔChcLeuRS 的基因克隆,表达和蛋白质纯化  30-31
      2.3. 从小牛肝tRNA 中分离tRNA~(Leu)  31-32
      2.4. 人胞质tRNALeu(AAG)和tRNAArg(ACG)的体外转录  32-36
      2.5. 酶活力和动力学常数的测定  36-37
      2.6. hcLeuRS 的自身免疫原活性的检测  37-38
      2.7. hcLeuRS 和?ChcLeuRS 的热稳定性测定  38
      2.8. 共聚焦显微镜(confocal fluorescence microscopy)观测hcLeuRS, ΔChcLeuRS, hcArgRS 和ΔNhcArgRS 在293T 细胞中的定位  38-39
      2.9. 免疫共沉淀(Immunoprecipitation,IP)实验所需的质粒构建和抗体制备  39-40
      2.10. 细胞培养,DNA 转染和免疫共沉淀(IP)实验  40
      2.11. Western 印迹实验(Western blot,WB)  40-41
      2.12. GST pull-down 实验  41-42
    3. 实验结果  42-53
      3.1 ΔChcLeuRS 的基因表达和蛋白质的纯化  42-43
      3.2 小牛肝tRNA 的分级和人胞质tRNA~(Leu)(AAG)和tRNA~(Arg)(ACG)的体外转录  43-45
      3.3 ΔChcLeuRS 的活力和动力学常数  45
      3.4 血清中和实验  45
      3.5. hcLeuRS 和ΔChcLeuRS 具有相似的热稳定性  45-46
      3.6. 293T 细胞中,hcLeuRS, ΔChcLeuRS, hcArgRS 和ΔNhcArgRS的亚细胞定位  46-48
      3.7. hcArgRS 和ΔNhcArgRS 的动力学常数  48-49
      3.8. hcLeuRS 的C-末端延伸肽段和hcArgRS 的N-末端延伸肽段相互作用  49-53
    4. 讨论  53-58
    5. 参考文献  58-66
  第二章氨基酰-tRNA 合成酶复合物中辅助因子对氨基酰-tRNA 合成酶具有活力促进作用  66-94
    摘要  66
    关键词  66
    1. 引言  66-69
    2. 材料和方法  69-74
      2.1. 试剂,质粒和菌株  69-70
      2.2. 基因克隆  70
      2.3. 基因表达  70-71
      2.4. GST 融合蛋白质和Hi56 融合蛋白质纯化  71-72
      2.5. 三种因子对aaRS 的氨基酰化活力影响的测定  72-74
      2.6. 三种因子对aaRS 的氨基酰化时间曲线影响的测定  74
    3. 实验结果  74-82
      3.1. GST 融合蛋白质的纯化和剪切  74
      3.2. His6 融合蛋白质纯化  74-75
      3.3. p43,p38 和p18 对aaRS 氨基酰化活力和时间曲线的影响  75-79
      3.4. p43,p38 和p18 对不同种属的LeuRS 的氨基酰化活力和时间曲线的影响  79-82
    4. 讨论  82-86
    5. 参考文献  86-94
结论  94-97
附录:本论文缩写汇编  97-101
在学期间发表的论文  101-103
致谢  103-104

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