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哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的原核和真核表达

作　者: 何超军
导　师: 吴志新；毛芝娟
学　校: 华中农业大学
专　业: 水产养殖
关键词: 哈维氏弧菌 外膜蛋白OmpK 原核表达 真核表达
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)是海水养殖中常见的革兰氏阴性致病菌,其细胞表面特有的外膜蛋白(outer membrane proteins, Omps)在维持细菌细胞结构稳定、物质交换及细菌的致病过程中起着十分重要的作用,并且部分种类如OmpK等具有良好的免疫原性。弧菌外膜蛋白OmpK是一种宽宿主的噬菌体KVP-40受体,其广泛存在于各种弧菌之中,是弧菌细胞表面一种组成性蛋白,具有与外界广泛接触的机会,很有可能是弧菌的表面抗原之一。根据已发表的哈维氏弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK的基因序列(登录号为AY332563)设计1对特异性引物,以哈维氏弧菌基因组DNA为模板通过PCR的方法扩增获得OmpK成熟肽基因片段,大小约为750bp,构建克隆载体pMD18T-OmpK,测序结果表明,该基因与已发表的哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因序列存在99%的同源性,初步表明成功克隆了OmpK成熟肽基因片段,且该序列在GenBank上的登录号为HQ395754。重组质粒pMD18T-OmpK经BamHⅠ和HindⅢ两种限制性内切酶双酶切后回收OmpK基因片段,并将此基因亚克隆至质粒pET30a,转入大肠杆菌BL21 (DE3)感受态细胞中,构建了原核表达工程菌E.coli/pET30a-OmpK,重组菌在IPTG的诱导下以包涵体的方式大量表达重组蛋白,重组蛋白分子量大小约为33kD,包涵体经EDTA、Triton、低浓度尿素等反复洗涤后,溶解至高浓度的尿素中,最后通过透析的方法使重组蛋白复性,复性的重组蛋白免疫新西兰兔制备了兔多抗OmpK血清。以已构建好的表达载体pET30a-OmpK为模板,根据pPIC9K分泌表达载体的特征设计一对特异性引物,通过PCR的方法扩增得成熟肽基因片段,然后连入pPIC9K质粒构建了重组表达载体pPIC9K-OmpK,重组质粒经菌落PCR、质粒双酶切以及测序鉴定,结果表明构建成功。大量抽提重组质粒pPIC9K-OmpK和亲本质粒pPIC9K,经SacⅠ线性化后通过电转的方法转入毕赤酵母GS115感受态细胞中。重组转化子GS115/pPIC9K-OmpK和GS115/pPIC9K经遗传霉素筛选获得了抗4.0mg/mL G418的高拷贝子；经MM/MD平板鉴定发现转化子大多为Mut+；经菌落PCR鉴定发现目的基因成功整合入毕赤酵母基因组中。阳性转化子在甲醇的诱导作用下分泌表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为37KD且被过度糖基化。重组蛋白经Western-Blot鉴定发现其能与原核表达的兔多抗OmpK包涵体血清发生反应,说明重组蛋白成功表达且其免疫原性不受影响。以表达载体pET30a-OmpK为模板,根据pPIC3.5K胞内表达载体的特征设计一对特异性引物,通过PCR方法扩增得OmpK成熟肽基因片段,然后连入pPIC3.5K质粒构建了穿梭载体pPIC3.5K-OmpK, SakⅠ线性化重组质粒pPIC3.5K-OmpK和亲本质粒pPIC3.5K后以氯化锂法转入毕赤酵母GS115,转化子经遗传霉素筛选抗2.0mg/mL G418的高拷贝子,经MM/MD平板鉴定其表型,随后抽提转化子的基因组DNA,以两对引物对其进行反复鉴定,结果表明成功构建了酵母阳性转化子GS115/pPIC3.5K-OmpK和GS115/pPIC3.5K,阳性转化子经甲醇的诱导后胞内表达重组蛋白,SDS-PAGE电泳结果表明重组蛋白分子量约为28.7KD,经酸洗玻璃珠法发现重组蛋白在胞内以包涵体的方式进行表达,Western-Blot鉴定发现其能与兔多抗OmpK包涵体血清发生反应,表明重组蛋白在胞内成功表达。

全文目录


摘要  7-9
Abstract  9-11
第1章 文献综述  11-23
  1.1 哈维氏弧菌的概况  11-13
    1.1.1 哈维弧菌的生物学特性  11-12
    1.1.2 哈维氏弧菌的流行病学  12-13
  1.2 巴斯德毕赤酵母表达系统  13-17
    1.2.1 毕赤酵母表达系统的操作流程  13-14
    1.2.2 菌株、载体、启动子  14-15
    1.2.3 外源基因的整合方式与拷贝数  15-16
    1.2.4 表达产物的糖基化  16-17
    1.2.5 外源基因的优化改造  17
  1.3 鱼用疫苗的研究进展  17-22
    1.3.1 传统疫苗  17-18
    1.3.2 新型疫苗  18-22
  1.4 本实验的目的与意义  22-23
第2章 哈维弧菌(Vibrio harveyi)外膜蛋白OmpK基因的克隆  23-30
  2.1 材料和方法  23-27
    2.1.1 菌株  23
    2.1.2 分子生物学试剂  23-24
    2.1.3 哈维氏弧菌总DNA的提取及OmpK成熟肽基因的扩增  24-25
    2.1.4 PCR产物的纯化  25
    2.1.5 感受态细胞的制备  25-26
    2.1.6 T载体与PCR产物的连接、转化及平板抗生素筛选  26
    2.1.7 碱裂解法小量制备重组质粒  26-27
    2.1.8 重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定  27
  2.2 结果与分析  27-29
    2.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR结果  27-28
    2.2.2 重组质粒的双酶切鉴定和测序鉴定  28-29
  2.3 讨论  29-30
第3章 OmpK原核表达载体的构建、表达与纯化  30-39
  3.1 材料与方法  31-34
    3.1.1 质粒与菌株  31
    3.1.2 主要试剂  31
    3.1.3 质粒pMD18T-OmpK与质粒pET30a的双酶切  31
    3.1.4 基因OmpK与质粒pET30a的连接、转化及平板抗生素筛选  31-32
    3.1.5 重组表达载体的双酶切鉴定  32
    3.1.6 重组蛋白的诱导表达  32
    3.1.7 重组蛋白表达方式的检测  32-33
    3.1.8 重组蛋白的纯化与浓缩  33-34
    3.1.9 重组蛋白浓度的测定及兔多抗血清的制备  34
  3.2 结果与分析  34-37
    3.2.1 重组质粒的双酶切鉴定结果  34-35
    3.2.2 重组蛋白的诱导表达及表达方式  35-36
    3.2.3 重组蛋白的纯化结果  36-37
  3.3 讨论  37-39
第4章 哈维氏弧菌外膜蛋白OmpK的克隆与真核分泌表达  39-57
  4.1 材料和方法  40-47
    4.1.1 质粒和菌株  40
    4.1.2 试剂与仪器  40
    4.1.3 外膜蛋白OmpK成熟肽基因的克隆  40-42
    4.1.4 重组质粒的单酶切线性化与纯化浓缩  42-43
    4.1.5 毕赤酵母GS115感受态细胞的制备  43
    4.1.6 电转化  43-44
    4.1.7 酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定  44
    4.1.8 酵母转化子的PCR鉴定  44-46
    4.1.9 阳性转化子的诱导表达  46
    4.1.10 表达产物的Western-blot分析  46-47
  4.2 结果与分析  47-55
    4.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR扩增  47
    4.2.2 穿梭载体pPIC9K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定  47-49
    4.2.3 重组质粒的线性化  49-50
    4.2.4 电转化及表型利用  50-52
    4.2.5 酵母转化子的PCR鉴定  52-53
    4.2.6 重组蛋白诱导表达  53-54
    4.2.7 表达产物的Western-blotting结果  54-55
  4.3 讨论  55-57
第5章 哈维弧菌外膜蛋白OmpK基因的克隆与真核胞内表达  57-70
  5.1 材料和方法  57-63
    5.1.1 实验材料与试剂  57-58
    5.1.2 胞内引物的设计  58
    5.1.3 穿梭载体的构建  58
    5.1.4 氯化锂转化GS115感受态细胞的制备  58-59
    5.1.5 氯化锂转化  59
    5.1.6 酵母转化子的高拷贝筛选及表型利用鉴定  59-60
    5.1.7 酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定  60-62
    5.1.8 阳性转化子的甲醇诱导表达  62
    5.1.9 重组蛋白表达方式的检测  62-63
    5.1.10 胞内重组蛋白的Western-blot分析  63
  5.2 结果与分析  63-69
    5.2.1 OmpK成熟肽基因的PCR扩增  63-64
    5.2.2 穿梭载体pPIC3.5K-OmpK的PCR鉴定及双酶切鉴定  64
    5.2.3 高拷贝转化子的筛选及表型利用鉴定  64-65
    5.2.4 酵母转化子基因组DNA的提取及PCR鉴定结果  65-67
    5.2.5 重组蛋白的诱导表达结果  67
    5.2.6 重组蛋白的表达方式  67-68
    5.2.7 表达产物的Western-blotting结果  68-69
  5.3 讨论  69-70
参考文献  70-80
附录  80-85
硕士期间发表的论文和参加的学术会议  85-86
致谢  86

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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