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转基因家蚕表达药用蛋白的研究

作　者: 崔琳琳
导　师: 薛仁宇
学　校: 苏州大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 转基因家蚕 PIZT/V5-His Piggybac hIL-28A hGM-CSF
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

hIL-28A是2003年美国科学家Kotenko和Sheppard等共同发现的一种新型白细胞介素,可发挥类似Ⅰ型干扰素的抗病毒、抗肿瘤及免疫调节功能;人粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(human granucyto-macrophage colony-stimulating factor, hGM-CSF)是一种重要的具有免疫调节功能的糖蛋白,在造血调控和免疫调节方面具有重要作用,其临床应用价值很高。为了探讨非转座子载体介导转基因家蚕表达外源基因的可能性,本研究采用精子介导法将构建的重组载体pIZT/V5-His-hIL-28A导入家蚕卵中,通过绿色荧光筛选并结合PCR、DNA杂交等分子鉴定,证实获得了转基因家蚕;Western blotting结果显示转基因家蚕表达重组hIL-28A的分子量为25 kDa,ELISA检测结果显示,hIL-28A在G3代转基因蚕、后部丝腺、脂肪组织冻干粉中的含量分别为0.198、0.320和0.238 ng/g。表明通过非转座子载体介导可以将外源基因导入家蚕基因组,并实现外源基因的表达。另外,为了研究转基因家蚕的遗传稳定性、所表达蛋白的活性及口服给药后效果,将本研究室先期制作的转hGM-CSF基因蚕(G4代)饲养传代至G12代,取每代转基因家蚕基因组进行PCR扩增,均能扩增出gfp、neo和gm-csf; ELISA检测结果显示,hGM-CSF蛋白在G12代转基因家蚕后部丝腺表达量为20.8 ng/g冻干粉(G3代表达量为5.15 ng/g冻干粉);将丝腺冻干粉溶解液加入到K562细胞培养液1640中,培养细胞,利用MTT法检测K562细胞数目,结果显示,能促进K562细胞数目的生长;同时将转基因蚕后部丝腺研磨液通过灌胃方式给药,能有效促进白细胞减少模型小鼠白细胞的生长。由此表明,转hGM-CSF基因家蚕具有一定的遗传稳定性,家蚕体内表达的hGM-CSF蛋白具有生物功能,并且可以通过口服方式给药,这为研究利用转基因家蚕表达口服化蛋白药物提供了依据。

全文目录

摘要  4-5
Abstract  5-9
引言  9-11
第一部分文献综述  11-26
  第一章白细胞介素(IL)-28/IL-29 研究概述  11-18
    1 IL-28／29 基因结构及编码蛋白  11-12
    2 IL-28/IL-29 来源  12
    3 IL-28/IL-29 的受体及信号转导  12-13
    4 IL-28/IL-29 的生物活性  13-15
    5. 展望  15
    参考文献  15-18
  第二章人粒细胞巨噬细胞集落刺激因子研究进展  18-26
    1 hGM-CSF 的概述  18-20
    2 hGM-CSF 的表达调控  20-22
    3 hGM-CSF 的表达  22-23
    4 重组hGM-CSF 的应用  23
    5 展望  23
    参考文献  23-26
第二部分研究报告  26-64
  第三章研究目的与研究内容  26-28
    1 研究目的及意义  26-27
    2 研究内容  27-28
  第四章实验材料与实验方法  28-43
    1 实验材料  28-33
    2 常用仪器  33-34
    3 实验方法  34-42
    4 参考文献  42-43
  第五章非转座子载体介导的转基因家蚕表达hIL-28A  43-55
    1 引言  43-44
    2 材料与方法  44-46
    3 结果与分析  46-50
    4 讨论  50-52
    参考文献  52-55
  第六章转hGM-CSF 基因家蚕遗传稳定性及其表达蛋白生物活性的研究  55-64
    1 引言  55-56
    2 实验材料与方法  56-58
    3 结果  58-62
    4 讨论  62-63
    5 参考文献  63-64
总结  64-65
  1 已取得的成果  64
  2 有待研究的内容  64-65
研究生期间发表文章  65-66
项目资助  66-67
附表一：英文简写对照表  67-69
致谢  69-71

转基因家蚕表达药用蛋白的研究

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