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农杆菌介导几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因遗传转化花生（Arachis hypogaea L.）的研究

作　者: 单世华
导　师: 庄伟建
学　校: 福建农林大学
专　业: 作物遗传育种
关键词: 花生再生体系几丁质酶基因 β-1 3-葡聚糖酶基因农杆菌遗传转化
分类号: S565.2
类　型: 博士论文
年　份: 2003年
下　载: 310次
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内容摘要

花生是重要的油料作物和经济作物，黄曲霉病是影响花生生产、加工和贸易的重要病害，在我国南方花生产区黄曲霉病尤其严重。目前在花生及其近缘种尚未发现高抗乃至免疫黄曲霉病的种质，单纯通过常规育种无法解决该问题，而通过基因工程技术将外源抗病基因转入花生栽培种则应具有一定的可行性。本研究即是以农杆菌LBA4404为介导将几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶双价基因转入花生栽培种泉花10号和金花1012，以提高其对黄曲霉病的抗性。研究结果表明：胚轴带部分子叶外植体在MS+5mg／L BA培养基有利于丛生芽潜伏茎诱导和伸长；减小子叶体积可延缓丛生芽伸长速度，促使其尽早吸收培养基中养分，且对芽诱导数量无影响。此后幼茎叶节在高浓度BA的MS培养基可产生大量丛生芽。胚轴外植体体胚诱导效果受种子收后贮藏时间的制约，新收获并干燥的花生种子体胚诱导率低，收后贮藏4～6月种子体胚诱导数量和速度均优于新收获种子；MS+40mg／L 2，4-D+0.5mg／L KT培养基既可诱导愈伤大量产生又能诱导体胚分化，将分化体胚直接转入MS+5mg／L BA诱导芽伸长可缩短试验周期约10d。MS+5mg／L BA+2mg／L NAA和MS+5mg／L BA+3mg／L NAA均可诱导胚小叶外植体产生愈伤和大量不定芽，后者产生的愈伤和芽相对较多，但褐化稍重。研究表明，200mg／L Km可作为花生芽伸长生长的最低抑制浓度，50mg／L Km为外植体生根的最低抑制浓度。不同花生外植体遗传转化结果表明：通过丛生芽再生途径利用Km筛选得到21株转化植株，其中泉花10号11株，平均转化率1.6％，金花1012为10株，平均转化率1.5％。PCR检测和PCR-Southern杂交证明目的基因已整合入花生基因组，目前得到数粒T₁代种子进行抢救性繁殖，有待于分离情况测定和抗病性鉴定。花生丛生芽再生途径的基因转化以预培养0、1d效果较好，其中预培养1d结合外植体福建农林大学博士学位论文划伤转化更佳;菌液侵染时间以10¹5min相对利于外源基因转化。胚状体和胚小叶再生途径基因转化目前仅分别得到数十粒抗性芽，需进一步诱导或伸长培养鉴定，二者均以10^ZOmin侵染时间较好，共培养均以72hr利于得到抗性芽，并且胚轴外植体基因转化时在体胚诱导伸长阶段进行Km筛选对提高抗性芽数量有利。子叶外植体转化褐化现象较严重，种子的新鲜程度和品种类型对转化有一定影响，目前仅得到1株抗性植株需进一步鉴定。研究发现，所使用的两品种间在不同的转化处理中也有一定差异。针对原有携带质粒载体的农杆菌菌株对抗生素不敏感的特点进行了菌株转换，质粒载体转入新的农杆菌菌株后，在含适宜浓度抗生素的固/液体YEP培养基皆完全被抑制，从而被成功用于本研究。为比较研究外源基因转化情况及抗性植株生长状况，选择烟草品种翠碧1号进行相同基因转化试验，PCR检测得到10株左右阳性植株，转化率为34⁷0%。研究发现，3^smin侵染时间较好，工程菌液浓度以OD600为0.5转化率最高。目前转化植株已得到种子，对后代的分离情况和抗病性鉴定也随后进行。

全文目录

中文摘要  5-7
英文摘要  7-9
1 前言  9-24
2 材料与方法  24-35
  2.1 花生再生体系的改良  24-25
    2.1.1 供试品种  24
    2.1.2 外植体材料准备  24
    2.1.3 花生不同外植体的优化培养  24-25
    2.1.4 组培实验条件  25
  2.2 花生基因转化材料与方法  25-35
    2.2.1 基因转化材料与试剂  25-26
    2.2.2 质粒载体的分子鉴定和农杆菌菌株的转换  26-29
    2.2.3 花生基因转化研究方法  29-31
    2.2.4 花生抗性植株的分子检测  31-34
    2.2.5 转化植株后代种子的繁殖  34-35
3 结果与分析  35-67
  3.1 花生不同再生体系优化结果分析  35-46
    3.1.1 花生丛生芽再生体系的优化分析  35-37
      3.1.1.1 丛生芽幼茎诱导培养效果  35
      3.1.1.2 外植体子叶留取体积对幼茎生长的影响  35-37
    3.1.2 花生胚状体再生体系优化分析  37-38
    3.1.3 花生胚小叶再生体系优化效果  38-40
      3.1.3.1 预培养天数对胚小叶生长的影响  38-39
      3.1.3.2 不同培养基对芽诱导的影响  39-40
      3.1.3.3 芽伸长培养基的摸索  40
    3.1.4 花生子叶外植体再生体系优化效果  40-46
    3.1.5 花生不同再生途径的效果分析  46
  3.2 农杆菌介导花生的遗传转化  46-64
    3.2.1 植物表达载体的分子鉴定和农杆菌菌株的转换  46-49
      3.2.1.1 植物表达载体的分子鉴定  46-47
      3.2.1.2 农杆菌菌株的转换  47-49
    3.2.2 花生Km抗性筛选浓度的确定及不同类型外植体的遗传转化  49-59
      3.2.2.1 花生芽伸长诱导Km最低抑制浓度的确定  49-50
      3.2.2.2 花生根系诱导Km抑制浓度的确定  50
      3.2.2.3 花生不同类型外植体遗传转化结果  50-58
      3.2.2.4 抗性植株的处理  58-59
    3.2.3 不同外植体基因转化效果比较  59-64
  3.3 转化植株的PCR检测  64-65
    3.3.1 花生基因组DNA提取  64
    3.3.2 抗性植株PCR反应体系的优化  64
    3.3.3 利用改良的PCR反应体系对转化植株的检测  64-65
  3.4 转化植株的PCR-Southern blot检测  65-67
4 结论与讨论  67-73
  4.1 关于花生组织培养再生技术  67-68
    4.1.1 丛生芽外植体再生技术研究  67
    4.1.2 体胚发生再生技术研究  67-68
    4.1.3 胚小叶外植体再生技术研究  68
  4.2 关于以农杆菌为介导花生外源基因转化  68-72
    4.2.1 关于不同外植体转化率的探讨  68-70
      4.2.1.1 丛生芽再生体系的遗传转化问题  68-69
      4.2.1.2 体胚再生体系的遗传转化问题  69
      4.2.1.3 胚小叶再生体系的遗传转化问题  69-70
    4.2.2 关于影响基因转化因素的探讨  70-72
      4.2.2.1 关于农杆菌变异问题  70
      4.2.2.2 关于共培养时间  70
      4.2.2.3 关于预培养时间  70-71
      4.2.2.4 关于工程菌液的处理及外植体侵染时间  71
      4.2.2.5 关于褐化问题  71-72
  4.3 后续工作  72-73
    4.3.1 研究中存在的主要问题  72
    4.3.2 有待于进一步深入研究的内容  72-73
参考文献  73-84
附录Ⅰ: 本研究所用质粒载体构建流程图  84-85
附录Ⅱ: 转化基因cDNA序列  85-87
附录Ⅲ: 部分英汉对照缩写词  87-88
附录Ⅳ: 对照植物烟草基因转化试验  88-91
附录Ⅴ: 学习期间发表论文与参与课题  91-92
致谢  92

农杆菌介导几丁质酶和β-1，3-葡聚糖酶基因遗传转化花生（Arachis hypogaea L.）的研究

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