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陈皮生物碱提取物抗肺纤维化的实验研究

作　者: 文高艳
导　师: 周贤梅
学　校: 南京中医药大学
专　业: 中西医结合临床
关键词: 陈皮生物碱提取物人胚肺成纤维细胞博莱霉素基质金属蛋白酶-9 基质金属蛋白酶抑制-1 肿瘤坏死因子-α
分类号: R285.5
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

目的：研究陈皮生物碱提取物(Citrus alkaloid extract, CAE),对人胚肺成纤维细胞(MRC-5)增殖的影响；运用博莱霉素(BLM)诱导的大鼠肺纤维化(PF)模型,研究陈皮生物碱提取物对大鼠PF的干预治疗作用,并探讨其可能的作用机制。方-法：1.将MRC-5细胞传代培养,待细胞进入对数生长期后进行实验。细胞分为正常对照组、药物实验组,采用四氮唑盐比色法(MTT法)对不同浓度的陈皮生物碱提取物进行实验,同时采用乳酸脱氢酶(LDH)测定法来检测陈皮生物碱提取物的细胞毒性。2.大鼠随机分为正常组、对照组、强的松组、陈皮生物碱提取物8mg/kg/day (CAE-8)组、16mg/kg/day (CAE-16)组,32mg/kg/day (CAE-32)组。各组大鼠每周称重,观察其体重变化；除正常组外,其余各组均采用BLM气管内注入建立PF模型。建模后正常组和对照组大鼠予生理盐水灌胃,其余各组大鼠分别给予陈皮生物碱提取物溶液灌胃。各组大鼠于实验第28天处死,留取血清及肺组织。将肺组织行HE及Masson染色观察肺组织病理学变化,判断肺泡炎和肺纤维化的程度。采用碱水解法及紫外分光光度检测法测定大鼠血清和肺组织中羟脯氨酸(HYP)的含量；分别使用反转录-聚合酶链反应(]RT-PCR)和蛋白质印记法(Western blotting)检测肺组织中肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、基质金属蛋白酶-9(MMP-9)及金属蛋白酶抑制剂-1(TIMP-1)的mRNA和蛋白的表达水平,并进行图像定量分析。结果：1.体外实验：陈皮生物碱提取物在不同浓度下均表现为抑制MRC-5增殖的作用,并随剂量变化呈量效关系。通过LDH法验证陈皮生物碱提取物对MRC-5细胞增殖的抑制作用为其药物活性而非其毒性。2.体重变化：陈皮生物碱提取物CAE-16组在第7天、第21天、第28天以及CAE-32组在第28天时体重增幅显著高于对照组(P<0.01)；CAE-8组在第7天时体重增幅明显高于强的松组(P<0.01)。3.肺泡炎及肺纤维化积分：陈皮生物碱提取物处理组(CAE-8,16,32组)肺泡炎及肺纤维化积分均显著低于对照组(P<0.01或P<0.05)。4.HYP含量测定结果：强的松组、陈皮生物碱提取物处理组(CAE-8,16,32组)肺组织及血清中HYP含量均低于对照组(P<0.05或P<0.01)。5.RT-PCR及Western blotting检测结果：和正常组比较：对照组大鼠肺组织中MMP-9的mRNA及蛋白表达水平均下降(P<0.05或P<0.01),同时,TIMP-1的mRNA及蛋白表达水平均显著升高(P<0.05),对照组肺组织中TNF-a mRNA及蛋白的表达水平均显著升高(P<0.05)。(1)各组药物处理组肺组织中MMP-9 mRNA表达水平和对照组比较,CAE-8组和CAE-32组均显著升高(P<0.05或P<0.01),强的松组和CAE-16也有所升高,但无统计学意义；各组药物处理组肺组织中TIMP-1 mRNA表达水平和对照组比较：CAE-32组、强的松组和CAE-16组均显著下降(P<0.05或P<0.01),CAE-8组也有所下降,但无统计学意义；各组药物处理组肺组织中TNF-a mRNA表达水平和对照组比较：强的松组、CAE-16组及CAE-32组显著下降(P<0.05),CAE-8组也有所下降,但无统计学意义。(2)各组药物处理组肺组织中MMP-9蛋白表达水平和对照组比较：强的松组、CAE-16组及CAE-32组均显著升高(P<0.05或P<0.01),CAE-8组也有所升高,但无统计学意义；各组药物处理组肺组织中TIMP-1蛋白表达水平和对照组比较：强的松组、CAE-8组、CAE-16组和CAE-32组均显著下降(P<0.05或P<0.01)。各组药物处理组肺组织中TNF-a蛋白表达水平和对照组比较：CAE-32组显著下降(P<0.01),强的松组、CAE-8及CAE-16均有所下降,但无统计学意义。结论：陈皮生物碱提取物对MRC-5增殖有明显的抑制作用。陈皮生物碱提取物能降低PF大鼠血清和肺组织中HYP的含量、抑制TNF-a的mRNA和蛋白表达,使MMP-9表达增高、TIMP-1表达下降。提示陈皮生物碱提取物具有一定的预防和治疗BLM诱导的PF大鼠的作用。其作用机制之一可能是通过抑制TNF-a表达,调节MMP-9与TIMP-1的平衡实现的。

全文目录

摘要  7-9
ABSTRACT  9-11
缩略词表  11-12
第一章前言  12-14
第二章材料和方法  14-23
  1. 实验材料  14-15
    1.1 实验动物  14
    1.2 实验药物、试剂及其配制  14-15
    1.3 主要仪器设备  15
  2. 实验方法  15-23
    2.1 陈皮生物碱提取物对MRC-5的作用  15-16
    2.2 动物分组  16
    2.3 建立动物模型  16-17
    2.4 实验药物给予  17
    2.5 标本采集  17
    2.6 观察指标  17-22
    2.7 统计学处理  22-23
第三章结果  23-30
  1. 体外实验结果  23-24
    1.1 陈皮生物碱提取物对MRC-5增殖活性的影响  23
    1.2 陈皮生物碱提取物对MRC-5细胞毒性作用  23-24
  2. 各组大鼠的一般情况变化  24-25
  3. 肺组织病理改变  25-26
    3.1 HE染色(参见图3-1～图3-6)  25
    3.2 Masson染色(参见参图3-7～图3-12)  25
    3.3 病理学分级及积分结果  25-26
  4. 血清和肺组织HYP含量  26
  5. 陈皮生物碱提取物对肺纤维化大鼠肺组织MMP-9/TIMP-1及TNF-α mRNA表达的影响  26-28
  6. 陈皮生物碱提取物对肺纤维化大鼠肺组织MMP-9/TIMP-1及TNF-α蛋白表达的影响  28-30
第四章讨论  30-38
  1. 中医对肺纤维化病名的认识  30
  2. 中医对肺纤维化病因病机的认识  30-31
  3. 中医对肺纤维化的辨证分型论治  31-32
    3.1 痰热郁肺、痰热互结型  31
    3.2 肺肾气阴两虚型  31
    3.3 脾肾阳虚型  31-32
    3.4 阴阳两虚型  32
  4. 相关细胞因子网络相互作用对肺纤维化形成的影响  32-34
    4.1 TGF-β  32
    4.2 TNF-α  32
    4.3 MMP  32-33
    4.4 CTGF  33
    4.5 ET  33
    4.6 PDGF  33
    4.7 IFN  33-34
  5. 动物模型的评价  34
  6. 陈皮生物碱提取物抗PF的作用  34-37
    6.1 陈皮生物碱提取物对MRC-5细胞增殖及细胞毒性的作用  34
    6.2 陈皮生物碱提取物对实验大鼠一般情况的影响  34-35
    6.3 陈皮生物碱提取物对实验大鼠肺组织病理形态的影响  35
    6.4 陈皮生物碱提取物对实验大鼠血清和肺组织HYP含量的影响  35
    6.5 陈皮生物碱提取物对实验大鼠肺组织MMP-9及TIMP-1的mRNA及蛋白表达的影响  35-36
    6.6 陈皮生物碱提取物对实验大鼠肺组织TNF-α mRNA及蛋白表达的影响  36-37
  7. 本实验结果对临床治疗肺纤维化的指导意义  37-38
第五章结论  38-39
附图  39-42
参考文献  42-45
攻读硕士学位期间取得的学术成果  45-46
致谢  46

陈皮生物碱提取物抗肺纤维化的实验研究

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