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1、卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的建立 2、ENO1在非小细胞肺癌中的功能研究

作　者: 张莹
导　师: 程书钧；高燕宁；吴令英；张开泰
学　校: 北京协和医学院
专　业: 肿瘤学
关键词: 卵巢癌 分泌/释放蛋白 蛋白质组 血浆 标志物 非小细胞肺癌 糖酵解途径 ENO1 细胞增殖
分类号: R737.31
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


背景卵巢癌是恶性程度最高的妇科肿瘤,其死亡-发病率(death-to-incidence ratio)在女性常见肿瘤中仅低于肺癌。早期卵巢癌患者的五年生存率远高于晚期卵巢癌患者,然而大多数病例在被诊断为卵巢癌时便已进展到晚期,足见早期诊断的必要性。外周血肿瘤相关蛋白标志物具有辅助诊断、判断预后及指导治疗的临床应用价值。目前,尚缺乏有效的用于卵巢癌早期诊断的外周血蛋白标志物。目的本项研究旨在建立卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组,经筛选和验证获得外周血中卵巢癌相关蛋白标志物,以期构建用于卵巢癌临床诊断的候选蛋白联合检测模型。方法以实验室前期开创的无血清原代器官培养模型为基础,本项研究对6例卵巢癌患者肿瘤组织及其对应正常卵巢组织进行体外无血清原代培养,然后收集各自的无血清条件培养基,经SDS-PAGE分离后,采用液相色谱和QSTAR XL电喷雾串联质谱仪(或SYNAPT HD离子迁移质谱仪)鉴定培养基中的蛋白全谱。继而采用GOFFA. PANTHER和MetaCore软件对鉴定出的蛋白数据进行GO富集分析和分子网络分析。随后,从数据库中挑选候选蛋白,主要采用双抗体夹心ELISA技术检测候选蛋白在不同人群血浆中的蛋白水平,包括59例卵巢癌患者、51例妇科良性疾患者和58例健康者。最后采用二分类逻辑回归法构建蛋白联合检测模型。结果通过质谱鉴定共获得1129个蛋白,构建了卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组。GO分析显示分泌蛋白和细胞膜蛋白占总蛋白的比例达到38.3%,总蛋白显著富集于“细胞外基质蛋白介导的信号转导”、“蛋白裂解和折叠”、“糖酵解”、“细胞结构”和免疫相关反应等生物学过程。随后,从该数据库中挑选了六个蛋白(NID1, TIMP2, VCAN、B2M, TF和CA125)在血浆样品中进行验证。结果显示,所有被测蛋白的血浆水平在卵巢癌患者和健康者之间均有显著差异(P<0.05),NID1、VCAN和CA125的血浆水平在良性疾患者和健康者之间存在显著差异(P<0.001),而B2M、TF和CA125的血.浆水平在卵巢癌患者和良性疾患者之间存在显著差异(P<0.001)。以此为基础,我们初步构建了蛋白联合检测模型。其中,3-蛋白标志谱(包括NID1、TIMP2和CA125)用于区分卵巢癌患者和健康者,其准确率、敏感性和特异性分别为98.3%、96.6%和100.0%。5-蛋白标志谱(包括NID1、TIMP2、B2M、TF和CA125)用于区分卵巢癌患者和非卵巢癌患者,其准确率、敏感性和特异性分别为89.9%、81.4%和94.5%。小样本的研究资料显示,上述3-蛋白标志谱和5-蛋白标志谱在诊断卵巢癌时的检测效能均优于CA125单一标志。结论本项研究所建立的卵巢癌相关分泌/释放蛋白数据库为体液中卵巢癌相关标志蛋白的后续研究提供了可靠的资源,从中可深入挖掘潜在的卵巢癌标志物；而初步构建的联合检测模型作为辅助卵巢癌临床诊断的候选模型,将进一步在独立样本中进行验证。背景在本实验室前期肺癌相关分泌/释放蛋白质组的工作中,无标记定量分析结果显示,有六个糖酵解代谢酶的蛋白水平在肺癌患者肿瘤组织无血清条件培养基中显著升高,烯醇化酶1(a-enolase, ENO1)是其中之一。进一步的验证则发现,它在非小细胞肺癌患者肿瘤组织和血浆中的蛋白水平均显著升高。目前,尚未见ENO1在肺癌中功能研究的报道。目的本项研究旨在初步探讨ENO1在非小细胞肺癌细胞中的生物学功能。方法采用Western blot方法检测人非小细胞肺癌细胞系(A549、H520、H1299、PG)、人永生化支气管上皮细胞系(M-BE和Y-BE)和小鼠胚胎成纤维细胞系(NIH/3T3)中ENO1蛋白表达水平。构建稳定过表达和瞬时下调ENO1蛋白的肺腺癌八549细胞模型和肺磷癌H520细胞模型,采用CCK-8细胞增殖实验和平板集落形成实验检测ENO1对A549细胞和H520细胞增殖能力的影响,随后借助划痕实验研究ENO1对A549细胞侧向运动能力的影响。采用Western blot方法检测稳定过表达和瞬时下调ENO1蛋白的A549细胞中细胞周期素Cyclin B1和Cyclin D1的水平。结果ENO1蛋白在NIH/3T3细胞系中表达量最低,在非小细胞肺癌细胞系中的表达量最高。它在不同阶段的M-BE细胞系的表达水平保持恒定,但在Y-BE细胞系中代和晚代的水平明显高于早代。稳定过表达ENO1蛋白可以促进A549细胞增殖和集落形成；瞬时下调ENO1蛋白可以减弱A549细胞增殖和集落形成。另外,ENO1并不能影响H520细胞增殖和集落形成。无论是稳定过表达还是瞬时下调ENO1蛋白都不改变A549细胞中Cyclin B1和Cyclin D1的表达水平。结论ENO1可能通过调控细胞周期以外的途径来促进A549细胞增殖。鉴于EN01对H520细胞增殖没有影响,提示它可能在肺鳞癌和肺腺癌细胞发生发展过程中的作用方式不同。

全文目录


目录  3-9
图表索引  9-12
英文缩略词  12-13
摘要  13-16
ABSTRACT  16-19
第一部分:卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的建立  19-78
  第一章 导论  19-38
    一、卵巢癌的异质性  19-25
      1. 卵巢上皮癌的组织起源  19-22
      2. 卵巢上皮癌的分型  22-25
    二、外周血卵巢癌相关蛋白标志物  25-31
      1. 卵巢癌筛查  25-27
      2. 外周血卵巢癌相关蛋白标志物的研究进展  27-31
    三、卵巢癌相关分泌蛋白质组  31-34
      1. 血浆蛋白质组  32-33
      2. 肿瘤组织周边液体蛋白质组  33
      3. 卵巢癌细胞系分泌蛋白质组  33-34
    四、肿瘤微环境与肿瘤进化  34-36
      1. 细胞外基质  34
      2. 肿瘤细胞外基质的"进化"  34-36
    五、本课题的研究目的和研究策略  36-38
  第二章 材料与方法  38-53
    一、实验材料  38-45
      1. 临床样品  38-41
      2. 蛋白水平检测系统  41-42
      3. 细胞培养主要材料与试剂  42
      4. 蛋白浓缩、定量和SDS-PAGE电泳主要材料与试剂  42-43
      5. 质谱鉴定主要材料与试剂  43
      6. ELISA主要材料与试剂  43
      7. IHC分析主要材料与试剂  43-44
      8. 常用试剂的配制  44-45
      9. 主要仪器  45
      10. 主要分析软件  45
    二、实验方法  45-53
      1. 原代器官培养  45-46
      2. 条件培养基的收集  46
      3. 条件培养基SDS-PAGE电泳分离  46-48
      4. 条件培养基蛋白全谱的LC-MS/MS鉴定分析  48-50
      5. 条件培养基蛋白全谱的生物信息学分析  50
      6. 血浆中条件培养基蛋白水平的检测  50-51
      7. 免疫组织化学染色  51-52
      8. 统计学分析  52-53
  第三章 实验结果  53-68
    一、原代器官培养及条件培养基的获得  53-54
      1. 卵巢癌患者肿瘤组织及其对应正常组织的原代器官培养  53-54
      2. 条件培养基的收集  54
    二、卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的建立  54-58
      1. 原代器官培养条件培养基的蛋白全谱鉴定  54-55
      2. 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的生物学特点  55-57
        2.1 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的GO分析  55-56
        2.2 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的network分析  56-57
      3. 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组与文献报道数据库的关系  57-58
        3.1 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组与人血浆蛋白数据库的关系  57-58
        3.2 卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组与其它卵巢癌相关分泌蛋白质组的关系  58
    三、实体瘤相关分泌/释放蛋白数据库的综合分析  58-61
      1. 实体瘤相关分泌/释放蛋白数据库的基本特点  59-60
      2. 肺癌、胰腺癌和卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组的特异性分析  60-61
        2.1 共同蛋白群的特点  60
        2.2 特异蛋白群的特点  60-61
    四、候选卵巢癌相关蛋白标志物的验证  61-65
      1. 待验证蛋白的挑选标准  61
      2. 血浆中候选蛋白水平的检测  61-64
      3. 组织中候选蛋白水平的检测  64-65
    五、卵巢癌联合检测模型的建立  65-68
      1. 区分卵巢癌患者和健康者的蛋白标志谱  65-66
      2. 区分卵巢癌患者和非卵巢癌患者的蛋白标志谱  66-68
  第四章 讨论  68-77
    一、卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组诠释卵巢肿瘤微环境的特点  68-69
    二、实体瘤相关分泌/释放蛋白数据库反映肿瘤微环境的共性  69-70
    三、卵巢癌相关分泌/释放蛋白质组富含候选标志物的信息  70-71
    四、候选卵巢癌相关蛋白标志物筛选和验证  71-74
      1."器官发育"sub-network  71-73
      2. 候选卵巢癌相关蛋白标志物验证  73
      3. 经期状态对血浆蛋白浓度的影响  73-74
    五、卵巢癌联合检测模型的开发  74
    六、对卵巢癌相关分泌/释放蛋白数据库的展望  74-77
      1. 待验证蛋白的挑选标准  75-76
      2. 卵巢癌相关分泌/释放蛋白的潜在临床价值  76
      3. 高通量蛋白检测平台的构建  76-77
  小结  77-78
第二部分:ENO1在非小细胞肺癌中的功能研究  78-109
  第一章 导论  78-85
    一、糖酵解途径与肿瘤  78-82
      1. 肿瘤细胞的Warburg效应  79-80
      2. Warburg效应的产生机制  80-82
    二、ENO1与肿瘤  82-84
      1. ENO1是潜在的肿瘤标志物  82-83
      2. ENO1在肿瘤发生发展中的生物学功能  83-84
    三、本课题的研究目的和研究策略  84-85
  第二章 材料与方法  85-97
    一、实验材料  85-90
      1. 细胞系  85
      2. 菌株及质粒载体  85-86
      3. 引物序列  86
      4. siRNA及siRNA转染试剂  86
      5. 抗体  86
        5.1 第一抗体  86
        5.2 第二抗体  86
      6. 主要试剂  86-88
        6.1 主要试剂盒  86-87
        6.2 其他主要试剂  87-88
          6.2.1 细胞培养和质粒转染  87
          6.2.2 蛋白提取和Western blot分析  87
          6.2.3 免疫细胞化学分析主要试剂  87-88
          6.2.4 分子生物学试剂  88
      7. 常用试剂的配制  88-89
      8. 主要仪器  89-90
      9. 主要分析软件  90
    二、实验方法  90-97
      1. 分子生物学方法  90-93
        1.1 构建ENO1真核表达质粒  90-93
        1.2 提取细胞总蛋白  93
        1.3 蛋白定量  93
        1.4 Western blot  93
      2. 细胞生物学方法  93-96
        2.1 细胞复苏  93-94
        2.2 细胞冻存  94
        2.3 细胞传代  94
        2.4 稳定过表达ENO1的A549细胞株和H520细胞株的筛选  94
        2.5 siRNA下调A549细胞和H520细胞中ENO1蛋白表达  94-95
        2.6 CCK-8细胞增殖实验  95
        2.7 平板集落形成实验  95
        2.8 划痕实验  95
        2.9 免疫细胞化学染色  95-96
      3. 统计学分析  96-97
  第三章 实验结果  97-104
    一、ENO1蛋白在各种细胞系中的表达情况  97-98
      1. ENO1蛋白在非小细胞肺癌细胞系和永生化支气管上皮细胞系中的表达情况  97
      2. ENO1蛋白在不同阶段永生化支气管上皮细胞系中的表达情况  97-98
    二、ENO1蛋白表达改变对细胞表型的影响  98-103
      1. ENO1基因真核表达质粒的构建  98-99
      2. 稳定过表达ENO1蛋白细胞株的筛选和鉴定  99
      3. siRNA下调内源性ENO1蛋白表达  99-100
      4. 稳定过表达和瞬时下调ENO1蛋白对非小细胞肺癌细胞增殖的影响  100-103
        4.1 稳定过表达和瞬时下调ENO1蛋白对肺腺癌细胞系A549细胞增殖的影响  100-101
        4.2 稳定过表达和瞬时下调ENO1蛋白对肺鳞癌细胞系H520细胞增殖的影响  101-103
    三、ENO1调控肺腺癌细胞增殖的分子机制  103-104
  第四章 讨论  104-108
    一、ENO1蛋白在肺癌发生早期开始表达异常  104-105
    二、ENO1促进肺腺癌细胞增殖  105-107
    三、ENO1可能抑制肺腺癌细胞的运动能力  107-108
  小结  108-109
参考文献  109-120
附表  120-173
致谢  173-175
个人简历  175-176

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 泌尿生殖器肿瘤 > 女性生殖器肿瘤 > 卵巢肿瘤
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