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胶质瘤miR-218与CDK6表达的相互关系及其对肿瘤细胞的增殖和凋亡的影响

作　者: 张景敏
导　师: 于士柱
学　校: 天津医科大学
专　业: 病理学与病理生理学
关键词: 胶质瘤 微小RNA 细胞周期蛋白依赖性激酶6 细胞增殖 凋亡
分类号: R739.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


[目的]微小RNA (microRNA, miRNA)是一类小分子非编码单链RNA,它可通过碱基互补配对的方式与靶mRNA特异性结合,最终导致靶mRNA的降解或转录后抑制,从而有效沉默靶mRNA的表达。(?)miRNA通过上述机制调控多种癌基因或抑癌基因的表达,故其表达异常与肿瘤的发生发展密切相关。近来的研究初步证实,miR-218是一种抑癌miRNA (Tumour suppressing miRNA, TS-miRNA)。已知在多种恶性肿瘤(如胃癌、乳腺癌)中miR-218表达异常减少导致的相应靶癌基因表达异常增加,在肿瘤细胞无限增殖、凋亡抑制、肿瘤间质血管生成及侵袭和转移等方面发挥了重要作用。生物信息学分析显示,细胞周期蛋白依赖性激酶6(Cyclin-dependent kinase, CDK6)的mRNA是miR-218的靶mRNA。CDK6是重要的细胞周期调控因子,它通过促使增殖期细胞由G1期进入S期而发挥促增殖作用。然而,胶质瘤细胞中miR-218及CDK6表达状况怎样,二者表达变化的相互关系及其在胶质瘤发生、发展中有何作用,miR-218对胶质瘤细胞增殖和凋亡的影响如何,均尚不清楚。本研究旨在对上述间题进行深入系统的探讨。[方法]①本研究采用组织微阵列、锁定寡核苷酸探针原位杂交及免疫组织化学方法,检测60例不同级别胶质瘤组织标本及10例对照脑组织中miR-218、CDK6及Ki-67抗原的表达状况,并分析三者之间的相互关系；②以恶性胶质母细胞瘤细胞系U87MG为研究对象,将U87MG细胞分为转染miRNA阴性对照序列(对照组)和miR-218 mimics (mimics组)两组；③采用qRT-PCR技术检测两组U87MG细胞中miR-218的含量；④采用免疫细胞化学染色方法检测两组U87MG细胞中CDK6及Ki-67的表达状况；⑤利用单细胞凝胶电泳技术检测两组U87MG细胞的凋亡程度；⑥利用MTT实验观察miR-218对U87MG细胞生长的影响。[结果]①锁定寡核苷酸探针原位杂交检测结果显示：对照组脑组织及Ⅰ～Ⅱ级、Ⅲ级和Ⅳ级胶质瘤组的miR-218阳性标记指数(LI%)分别为22.45±0.59、4.00±1.07、1.87±1.06、0.94±±0.78,四组间的差异均有统计学意义(P<0.05～0.001)。②免疫组织化学检测结果显示：以上四组的CDK6 LI%分别为7.25±1.20、16.71±0.80、24.43±0.62、32.05±0.43,对照组与各胶质瘤组间及Ⅰ～Ⅱ级胶质瘤组与Ⅳ级胶质瘤组间的差异有统计学意义(P<0.01～0.001)；以上四组的Ki-67阳性细胞密度分别为0.0-0.00、9.30±3.48、31.15±9.44、60.15±13.60(x±s/0.05mm2),四组间间间的差异均有统计学意义(P<0.01)。③直线相关性分析显示：miR-218 LI%与CDK6 LI%及Ki-67阳性细胞密度间均呈显著性负相关(r=-0.480～-0.534,P<0.01),后两者间呈显著性正相关(r=0.530,P<0.01)。④qRT-PCR检测结果显示：转染miR-218 mimics组U87MG细胞中miR-218含量显著高于对照组U87MG细胞,差异有统计学意义(P<0.001)；免疫细胞化学检测结果显示：mimics组U87MG细胞的CDK6及Ki-67 LI%(14.74±1.19、30.88±3.31)均明显低于对照组U87MG细胞(79.06±2.07、64.94±3.96),差异均有统计学意义(P<0.001)。⑤单细胞凝胶电泳检测结果显示：mimics组及对照组U87MG细胞的凋亡指数(AI%)分别为68.44±7.05、13.04±0.97,两组间差异有统计学意义(P<0.001)。⑥MTT检测结果显示：mimics组及对照组U87MG细胞在24h、48h、72h和96h时的相对吸光度值分别为0.64±0.02、0.72±0.08、1.35±0.28、1.63±0.14和0.67±0.06、1.23±0.14、1.91±0.04、2.19±0.22；自转染48小时后,各时间点mimics组U87MG细胞的存活数明显少于对照组,差异有统计学意义(P<0.05-0.001)。[结论]①在胶质瘤细胞中普遍存在miR-218表达异常减少和CDK6表达异常增加,二者的表达水平对评价胶质瘤良恶性程度有重要参考价值；②miR-218表达异常减少可导致胶质瘤细胞CDK6表达及增殖活性增强；③补充外源性miR-218可有效下调恶胶质瘤细胞CDK6表达、抑制其增殖和促进其凋亡,故在恶性胶质瘤基因治疗中具有重要的潜在应用价值。

全文目录


中文摘要  4-6
Abstract  6-10
英文缩略语索引  10-11
前言  11-16
  研究现状、成果  11-15
  研究目的、方法  15-16
材料与方法  16-26
  1.主要实验仪器  16
  2.实验材料  16-17
    2.1 病例的选择  16
    2.2 胶质母细胞瘤细胞系的选择  16
    2.3 生物信息学预测软件及网站资源  16-17
  3.主要试剂  17
  4.实验方法  17-25
    4.1 组织微阵列的制备  17
    4.2 锁定核苷酸探针原位杂交  17-19
    4.3 免疫组织化学染色  19-20
    4.4 细胞培养、转染及分组  20
    4.5 qRT-PCR检测细胞中miR-218的量  20-22
    4.6 免疫细胞化学染色  22-23
    4.7 细胞凋亡的单细胞凝胶电泳检测  23-24
    4.8 MTT测定U87MG细胞的生存状况  24-25
  5.统计学方法  25-26
结果  26-34
  1.对照组脑组织及各胶质瘤组miR-218表达状况的检测  26-27
  2.对照组脑组织及各胶质瘤组CDK6表达状况的检测  27-28
  3.对照组脑组织及各胶质瘤组Ki-67表达状况的检测  28-29
  4.对照组及各胶质瘤组miR-218与CDK6表达和增殖活性的关系  29
  5.miR-218靶基因的生物信息学预测  29-30
  6.对照组及mimics组U87MG细胞中miR-218含量的检测  30-31
  7.对照组及mimics组U87MG细胞中CDK6及Ki-67表达的检测  31-32
  8.对照组及mimics组U87MG凋亡细胞的检测  32-33
  9.对照组及mimics组U87MG细胞生存状况的MTT检测  33-34
讨论  34-39
  1.胶质瘤细胞的miR-218表达变化  34-35
  2.胶质瘤细胞的CDK6表达变化  35-36
  3.胶质瘤细胞miR-218和CDK6表达及增殖活性的相互关系  36-37
  4.胶质瘤细胞miR-218表达异常影响其增殖及凋亡的机制验证  37-39
结论  39-40
参考文献  40-44
发表论文和参加科研情况说明  44-45
综述 microRNA与胶质瘤相关性研究进展  45-61
  综述参考文献  54-61
致谢  61

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 神经系肿瘤
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