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脱-γ-羧基凝血酶原促进肝癌增殖与转移机制研究

作　者: 岳攀
导　师: 曲显俊
学　校: 山东大学
专　业: 药理学
关键词: DCP 增殖侵袭 MMPs ERK1/2MAPK 促血管生长因子维生素k2
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

研究背景凝血酶原是在肝脏中合成的血清凝血因子,也是凝血酶的前体物。在凝血酶原前体的谷氨酸区有十个谷氨酸残基,当有足够的维生素K存在时,这些谷氨酸残基将全部转化成γ-羧基谷氨酸而成为正常凝血酶原。当维生素K不足或存在维生素K拮抗剂时,这些谷氨酸未被全部羧化而称为脱-Y-羧基凝血酶原(DCP)。由于γ-羧基谷氨酸中的羧基是与钙结合的一个功能区,它的缺乏失去了与钙结合的基础,故DCP无凝血酶原的功能。DCP作为肝癌标志物已用于临床诊断中。研究DCP的结构可以发现,其中有两个结构域与肝细胞生长因子(HGF)相似,这两个结构域被认为能促进成熟肝细胞的有丝分裂。DCP在血清和组织中的表达与肝癌的恶化程度及血管侵袭程度密切相关。在我们前期的研究中发现DCP能够促进人脐静脉内皮细胞株(HUVEC)的增殖与转移。本课题主要研究DCP对人肝癌细胞增殖与转移的影响及细胞信号传导通路。试验方法DCP促进肝癌增殖、转移机制研究：选用人肝癌细胞株HLE及SK-Hep,两种细胞株均不产生DCP。CCK-8法检测DCP对肝癌细胞增殖的影响；AnnexinV/PI双染法检测肝癌细胞凋亡率；Transwell chamber法检测DCP对肝癌细胞侵袭的影响；明胶酶谱法(Gelatin zymography)检测DCP对肝癌细胞基质金属蛋白酶(MMPs)活力的影响；Western blot法检测DCP对肝癌细胞MMPs、p-Met、EGFR、p-EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c-Raf表达水平的影响；进一步试验采用PD98059阻断ERK1/2MAPK信号传导通路,Western blot法检测DCP对肝癌细胞生成MMPs的影响。ELISA法和Western-blot法检测DCP对肝癌细胞生成促血管生成因子的影响。维生素K2(VitK2)对肝癌增殖和侵袭作用研究：选用人肝癌细胞株PLC/PRF/5和HepG2, Western blot法检测维生素K2对肝癌细胞生成DCP的影响,MTT法检测维生素K2对肝癌细胞增殖的影响；Transwell chamber法检测维生素K2对肝癌细胞侵袭的影响。试验结果DCP促进肝癌细胞增殖、侵袭并激活ERK1/2MAPK细胞信号传导通路：CCK-8法检测发现DCP能够显著促进肝癌细胞HLE和SK-Hep的增殖,与正常凝血酶原对照组比较有显著性差异。160ng/ml浓度DCP孵育48h,HLE细胞增殖最高达到51.2%；AnnexinV/PI双染法检测发现DCP能够对抗erlotinib诱导的HLE细胞凋亡；明胶酶谱法检测发现DCP能够增强肝癌细胞HLE和SK-Hep生成的MMPs活力,同时Transwell chamber法检测发现DCP能够促进肝癌细胞穿过人工基底膜；Western blot法检测发现DCP能够提高肝癌细胞MMPs、p-Met、p-EGFR、EGFR、p-ERK1/2、p-MEK1/2和p-c-Raf的表达水平；同时ERK1/2MAPK信号传导通路特异性阻断剂-PD98059能够抑制DCP诱导肝癌细胞HLE和SK-Hep表达MMPs,50μM的PD98059即有明显抑制作用,80μM的PD98059几乎完全抑制了MMPs的表达。提示DCP诱导MMPs表达作用与ERK1/2MAPK信号传导通路有关。ELISA法和Western blot法检测发现DCP能够促进血管生成因子VEGF, TGF-α和bFGF的表达。维生素K2抑制肝癌细胞增殖和侵袭：Western blot法检测发现VitK2能够抑制肝癌细胞PLC/PRF/5和HepG2生成DCP,同时抑制细胞的增殖和侵袭能力：当VitK2浓度达到40μM,孵育120h,对PLC/PRF/5细胞的增殖抑制率最高达到48.2%,在HepG2细胞也观察到相似的抑制作用；2-40μM的VitK2能够明显抑制PLC/PRF/5细胞的侵袭能力,最高抑制率达到72.4%。结论DCP能够显著促进肝癌细胞的增殖和侵袭,其机制与DCP促进肝癌细胞生成MMPs有关。通过ERK1/2MAPK通路特异性阻断剂-PD98059阻断试验发现DCP通过EGFR-Ras-Raf-MEK-ERK信号传导通路调节肝癌细胞生成MMPS。另外,维生素K2能够通过抑制DCP的产生抑制肝癌细胞的增殖和侵袭。

全文目录

中文摘要  9-12
Abstract  12-15
符号说明  15-17
前言  17-27
  1.DCP的生成  17-20
  2.DCP的临床应用  20-23
  3.DCP与Hcc之间的相关性  23-25
  4.维生素K通过降低DCP水平抑制肝癌  25
  5.前景展望  25-26
  6.总结  26-27
第一章 DCP促进肝癌细胞增殖作用研究  27-39
  1. 材料  27-30
  2. 方法  30-32
    2.1 CCK-8法检测肝癌细胞增殖  30
    2.2 Annexin V/PI双染法检测肝癌细胞凋亡  30
    2.3 Western Blot检测p-c-Met、p-EGFR和EGFR的表达水平  30-32
  3. 数据处理  32
  4. 结果  32-35
    4.1 DCP促进肝癌细胞增殖  32-33
    4.2 DCP抵抗erlotinib诱导的肝癌细胞凋亡  33
    4.3 DCP促进p-c-Met、p-EGFR和EGFR的表达  33-35
  讨论  35-39
第二章 DCP促进肝癌细胞侵袭作用及机制研究  39-64
  第一节 DCP促进肝癌细胞基质金属蛋白酶表达及信号通路研究  39-59
    1. 材料  39-43
    2. 方法  43-46
      2.1 Transwell chamber法检测肝癌细胞侵袭  43
      2.2 明胶酶谱法检测MMPs活力  43-44
      2.3 Western Blot检测MMPs的表达水平  44-46
      2.4 Western Blot检测p-ERK1/2、p-MEK1/2、p-c-Raf的表达水平  46
      2.5 Western Blot检测PD98059对MMPs表达水平的影响  46
    3. 数据处理  46-47
    4. 结果  47-52
      4.1 DCP促进肝癌细胞侵袭  47
      4.2 DCP增强MMPs活力  47-48
      4.3 DCP促进MMPs表达  48
      4.4 DCP激活ERK1/2 MAPK信号传导通路  48-49
      4.5 DCP通过ERK1/2 MAPK信号传导通路调节肝癌细胞MMPs表达  49-52
    讨论  52-59
  第二节 DCP促进肝癌血管生成因子表达作用研究  59-64
    1. 材料  59
    2. 方法  59-60
      2.1 ELISA法检测血管生成因子表达水平  59-60
      2.2 Western Blot检测血管生成因子表达水平  60
    3.数据处理  60
    4.试验结果  60-62
      4.1 DCP促进血管生成因子表达  60
      4.2 DCP促进血管生成因子表达  60-62
    讨论  62-64
第三章维生素K_2对肝癌抑制作用研究  64-70
  1. 材料  64
  2. 方法  64-65
    2.1 Western Blot检测VitK_2对DCP表达水平的影响  64
    2.2 MTT法检测肝癌细胞增殖  64-65
    2.3 Transwell chamber法检测肝癌细胞侵袭  65
  3.数据处理  65
  4. 结果  65-67
    4.1 VitK_2抑制肝癌细胞DCP表达  65
    4.2 VitK_2抑制肝癌细胞增殖  65-66
    4.3 VitK_2抑制肝癌细胞侵袭  66-67
  讨论  67-70
参考文献  70-80
致谢  80-81
攻读学位期间发表论文  81-82
附录  82-92
学位论文评阅及答辩情况表  92

脱-γ-羧基凝血酶原促进肝癌增殖与转移机制研究

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