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茶树咖啡酸氧甲基转移酶基因的克隆及表达分析

作　者: 李小霞
导　师: 江昌俊
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 茶学
关键词: 茶树 咖啡酸氧甲基转移酶 原核表达 实时定量PCR
分类号: S571.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


茶树(Camellia sinensis)是重要的木本经济作物之一。木质素是植物界中仅次于纤维素的天然有机资源,茶树体内木质素的含量和各单体比例与茶树抗逆性、茶叶品质等方面有关。咖啡酸氧甲基转移酶(caffeic acid o-methyltransferase,COMT)是木质素生物合成中的关键酶之一。本研究以元宵绿品种为材料,克隆了COMT基因cDNA全长,并进行了原核表达及实时定量分析,以期为将来通过调控该基因的表达量,提高茶树叶片的持嫩性及茶树的抗逆性奠定基础。主要研究结果如下:(1)根据其他作物中已克隆的COMT基因氨基酸序列,设计简并引物,通过RT-PCR扩增得到317 bp的特异片段,通过RACE法获得茶树COMT基因cDNA,全长为1381 bp,Genbank登录号为HM204933。此基因包含一个长1092 bp的开放阅读框,编码393个氨基酸,5’端非编码区和3’端非编码区分别为77 bp、212 bp。经GenBank数据库Blast分析,其核苷酸序列与欧洲白桦、苎麻、中果咖啡和毛果杨的COMT基因相似性分别为80%、78%、77%、77%,氨基酸序列与毛果杨的COMT基因相似性达到100%。(2)设计特异引物,PCR扩增COMT开放阅读框片段,插入到表达载体pET-32a中,转化表达宿主菌BL21trxB(DE3),IPTG诱导后高效表达产生分子量约为60 KD的融合蛋白。该融合蛋白包括20 kD的Trx(硫氧还蛋白)和40 kD的COMT蛋白。随着诱导时间的变化,融合蛋白表达量递增,表明COMT基因在大肠杆菌中得到了表达。(3)实时荧光定量PCR结果表明,茶树不同生长阶段的叶片中都有COMT基因的表达,其表达量随着成熟度的增大而增大。(4)通过对水古、浙江紫笋、龙井43、平阳特早四个品种的芽下第一叶中COMT基因的表达量分析得到,其表达量大小依次为龙井43>水古>浙江紫笋>平阳特早,其结果与材料采摘时的成熟程度一致。

全文目录


摘要  5-6
ABSTRACT  6-9
第一章 文献综述  9-16
  1.1 木质素的种类与分布  9
  1.2 木质素的生物合成  9-11
  1.3 木质素的生物功能  11-13
    1.3.1 木质素与植物抗逆性  11-12
    1.3.2 木质素对嫁接的影响  12
    1.3.3 木质素与绿色农业  12-13
  1.4 氧甲基转移酶（COMT）的研究进展  13-15
    1.4.1 COMT 催化底物的研究  13-14
    1.4.2 COMT 保守区域  14
    1.4.3 组织表达特性  14-15
  1.5 研究目的与意义  15-16
第二章 茶树 COMT 基因 cDNA 全长的克隆  16-29
  2.1 材料和方法  16-21
    2.1.1 试验材料  16
    2.1.2 试验方法  16-21
  2.2 结果与分析  21-29
    2.2.1 茶树RNA 的提取  21
    2.2.2 COMT 基因片段的获得  21-22
    2.2.3 COMT 基因全长的获得  22-23
    2.2.4 同源性分析  23-25
    2.2.5 系统进化树分析  25
    2.2.6 COMT 蛋白亲水性和疏水性分析  25-26
    2.2.7 信号肽分析  26-27
    2.2.8 二级结构的预测  27-29
第三章 COMT 基因的原核表达  29-34
  3.1 材料和方法  29-31
    3.1.1 材料  29
    3.1.2 方法  29-31
  3.2 结果与分析  31-34
    3.2.1 表达载体的构建与重组表达质粒的鉴定  31-32
    3.2.2 融合表达载体pET32a-COMT 在大肠杆菌中的诱导表达和SDS-PAGE 电泳分析  32-34
第四章 基因表达量分析  34-36
  4.1 材料与方法  34-35
    4.1.1 试验材料  34
    4.1.2 实验方法  34-35
  4.2 结果与分析  35-36
    4.2.1 同一品种不同成熟度叶子中COMT 的表达  35
    4.2.2 不同品种间同一部位的叶子其COMT 的表达情况  35-36
第五章 讨论  36-38
  5.1 RACE 技术克隆茶树COMT 的优越性  36-37
  5.2 茶树中COMT 在叶片成熟过程中的作用  37-38
第六章 结论  38-39
参考文献  39-45
致谢  45-46
作者简介  46

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中图分类: > 农业科学 > 农作物 > 经济作物 > 饮料作物 > 茶
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