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重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗排斥反应的实验研究

作　者: 李来邦
导　师: 李立；冉江华；李晓延
学　校: 昆明医学院
专　业: 外科学
关键词: 大鼠肝移植两袖套法排斥反应 galectin-9 基因克隆腺病毒载体急性排斥反应
分类号: R657.3
类　型: 博士论文
年　份: 2009年
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内容摘要

第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立目的：建立稳定的大鼠原位肝移植的急性排斥反应模型并观察其急性排斥反应的特点。为进一步的实验研究搭建坚实的技术平台。方法：1采用改良“二袖套管法”,利用封闭群SD大鼠进行大鼠肝移植模型技能训练。2对照研究DA-Lewis, Lewis-Lewis配对组合的肝移植后排斥反应,分别观察术后第4d、7d、10d天症状、体征、肝功能变化、移植肝病理特征等的变化,并对肝移植急性排斥反应模型制备作出客观评价,每组另5只观察生存时间。结果：1技能练习阶段受体大鼠的存活时间大多不超过72小时。此时段主要为手术操作技能的训练、围手术期管理积累经验。2正式实验中两组术后血清ALT同期比较Lewis-Lewis组明显低于DA-Lewis组(P<0.01)差异有显著性,DA-Lewis组随着术后时间延长ALT呈进行性的升高(P<0.01),而Lewis-Lewis组ALT逐渐下降,组内比较差异无显著性。3正式实验中两组术后血清TBIL第7d、10d两组比较Lewis-Lewis组明显低于DA-Lewis组(P<0.01)差异有显著性：随着术后时间延长DA-Lewis组TBIL呈进行性的升高(P<0.01),而Lewis-Lewis组TBIL无明显升高,组内比较差异无显著性。4正式实验中术后7d、10d, DA-Lewis组移植肝脏病理可见汇管区三体(肝动脉、门静脉和胆管汇管)炎细胞浸润大量淋巴细胞浸润,肝小叶结构破坏明显,肝细胞呈灶块状坏死,肝实质内散在一些淋巴、单核、中性粒细胞浸润。少数汇管区内有小胆管破坏。Banff评分Ⅱ-Ⅲ级。而Lewis-Lewis组,肝脏病理可见汇管区三体(肝动脉、门静脉和胆管汇管)少量淋巴细胞浸润,浸润程度未达到急性排斥的诊断标准,Banff评分0级。结论：1大鼠原位肝移植模型制作难度较大,影响因素众多。熟练的显微外科技术,完善的围手术期处理及耐心细致熟练的操作是决定大鼠原位肝移植模型制作成功的关键。2 DA-Lewis组大鼠肝移植出现明显、稳定的排斥反应的特征,可作为ROLT急性排斥模型进行相关的研究。第二部分大鼠galectin-9基因的克隆及重组腺病毒载Ad5-galectin-9的构建和包装目的：克隆大鼠galectin-9基因全长cDNA,构建含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,并予以鉴定方法：从大鼠的肝脏组织中用RT-PCR的方法克隆扩增大鼠galectin-9基因,再定向插入到NotⅠ和Hind III酶切的pDC316穿梭质粒中,获得穿梭质粒pDC316-galectin-9,经PCR、NotⅠ和HindⅢ酶切及测序等鉴定后,用脂质体将穿梭质粒pDC316-galectin-9与腺病毒骨架质粒PBHGloxΔE1.3Cre共转染293细胞,经位点特异性重组获得含目的基因的重组腺病毒Ad5-galectin-9,行PCR鉴定,经293细胞扩增、纯化制备高滴度病毒液,TCID50法测定病毒滴度。结果：PCR、酶切及测序证实穿梭质粒构建正确,PCR鉴定证实大鼠galectin-9基因重组腺病毒载体构建正确,病毒的感染滴度为1.4×109IU/ml。结论：成功构建了含大鼠galectin-9基因的重组腺病毒载体,为进一步研究大鼠galectin-9基因的功能奠定了基础。第三部分Ad5-galectin-9对大鼠肝移植抗急性排斥发应的实验研究目的：研究重组腺病毒载体Ad5-galectin-9对肝移植后急性排斥反应的抑制作用及探讨其相关机制。方法：供体选用雄性DA大鼠,受体选用Lewis大鼠。采用改良Kamada’S"二袖套法”建立肝移植模型。实验动物随机分成5个组：A组为对照组(n=24)；B组为空载体组(n=24),夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注lml空载体,保存60min; C组为环抱素组(n=24),术后2d开始给予环孢素A处理,10mg/kg,每天一次；D组为Ad5-galectin-9组(n=24),夹闭移植肝肝上及肝下下腔静脉,经门静脉灌注2ml、肝动脉灌注1ml 1.0×109IU/ml的Ad5-galectin-9载体,保存60min; E组为Ad5-galectin-9+CsA组(n=24),同D组,术后2d开始给予环孢素A处理,5mg/kg,每天一次。各组分成4个亚组(n=6),留1个亚组观察大鼠移植后生存期,另外3个亚组分别于移植后4d、7d和10d处死大鼠,检测血清ALT, AST, TBIL水平；ELISA法测定IL-2 IL-4 IL-10和IFN-y水平；用流式细胞仪检测肝细胞和Thl细胞凋亡；肝组织行HE染色,进行病理组织学检查并进行评分(根据Banff分级评分方案)；Werstern blotting测定Galectin-9蛋白的表达。结果：和A、B组比较, C、D、E组生存期明显延长(P<0.05);移植术后各组大鼠血清生化检查：在移植术后4、7、10d肝功能C、D和E组逐渐恢复,A、B组ALT AST TBIL急剧上升,与存活时间表现一致。A、B组IL-2 IFN-γ明显高于C、D和E组(P<0.01),且与C组比较,D、E组下降更明显(P<0.05)；IL-4、IL-10值A、B组明显低于C、D和E组(P<0.01)。A、B组的排斥发应活动指数(RAI)明显高于C、D和E组(P<0.05),差异有显著性。C、D和E组的肝细胞凋亡率明显低于A、B组(P<0.01),差异有显著性。结论：(1) Ad5-galectin-9可以改善肝功能、降低移植肝排斥反应病理学评分(RAI),延长其生存期。(2)CsA延长了所转导基因Ad5-galectin-9在移植肝的表达,对Ad5-galectin-9抑制肝移植后急性排斥反应起协同作用。(3) Ad5-galectin-9通过特异性诱导Th1细胞凋亡,抑制肝移植后的急性排斥反应。(4) Ad5-galectin-9可以抑制移植肝细胞调亡,保护肝功能。(5) Galectin-9有可能成为抑制或治疗急性排斥反应的新型药物。

全文目录

前言  7-9
中文摘要  9-13
英文摘要  13-18
第一部分大鼠原位肝移植急性排斥反应模型的建立  18-53
  材料与方法  19-34
  结果  34-41
  讨论  41-49
  结论  49-50
  参考文献  50-53
第二部分大鼠Galectin-9基因的克隆及重组腺病毒载体Ad5-Galectin-9的构建和包装  53-83
  材料和方法  53-67
  结果  67-75
  讨论  75-79
  结论  79
  参考文献  79-83
第三部分重组腺病毒载体Ad5-Gal-9对大鼠移植肝抗排斥反应的实验研究  83-123
  材料和方法  84-96
  结果  96-115
  讨论  115-118
  结论  118-119
  参考文献  119-123
综述:肝脏移植的基因治疗  123-137
攻读学位期间发表的文章  137-138
致谢  138

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