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Let-7 microRNA在小鼠胎肺发育时期的表达检测及其腺病毒穿梭质粒的构建

作　者: 王虹
导　师: 张彦定
学　校: 福建师范大学
专　业: 发育生物学
关键词: let-7 microRNAs mK-ras 胎肺发育 腺病毒载体
分类号: Q78
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要


微RNA (microRNA,miRNA)是一类在进化上高度保守、长度约20～24个核苷酸的小分子非编码RNA,能通过与靶基因3’非翻译区相结合,从而抑制靶基因的翻译或降解靶基因。Let-7 microRNA是发现较早的一类niRNA,最早在线虫上发现let-7能调控细胞分裂的时序。此后大量证据表明,let-7参与动物多个器官发育的调控过程,并与人类疾病发生密切相关。本研究利用real-time PCR技术检测了let-7家族8个成员在小鼠胚胎肺发育过程中的表达趋势,发现从小鼠假腺肺的前中期到囊状肺的前期,let-7家族8个成员均有表达,且表达量均持续升高,到囊状肺的中后期,其中let-7a、let-7d、let-7e、let-7f、let-7i五个家族成员表达量略有下降,let-7b、let-7c表达量没有明显变化、而let-7g表达量则有所升高。接着,本实验选取8个家族成员中表达丰度最高的let-7a和let-7d,利用原位杂交技术分析它们在小鼠胚胎肺发育过程中的表达模式,结果表明：let-7a和let-7d在小鼠胚胎肺的上皮和间充质中均有明显表达,且在肺芽远端上皮末梢中的表达较为强烈,到出生后三天(P3),其在胚胎肺上皮和间充质中的表达减弱,这种表达趋势的变化与real-time PCR的结果相近。在此基础上,本实验通过构建pDC316-CMV-control、pDC316-CMV-let-7a以及pDC316-mCMV-mK-ras三个腺病毒表达载体,并将其分别转染细胞,利用RT-PCR以及western blot的方法检测所构建的表达载体,实验结果表明,以pDC316-CMV-control作为对照组,pDC316-CMV-let-7a、pDC316-mCMV-mK-ras两个腺病毒表达载体在mRNA水平及蛋白质水平上均能实现体外过表达。本研究旨在为后期构建腺病毒,并在小鼠体内研究let-7 miRNAs与mK-ras基因负调控关系,及其参与调控哺乳动物胚胎肺发育的分子机制奠定基础。

全文目录


中文摘要  2-3Abstract  3-4中文文摘  4-7目录  7-9绪论  9-15第一章 实验材料与方法  15-29  1.1 实验材料  15-18    1.1.1 菌株和载体  15    1.1.2 细胞和实验动物  15    1.1.3 实验仪器与设备  15    1.1.4 实验耗材  15    1.1.5 主要实验药品及试剂  15-16    1.1.6 试剂配制  16-18    1.1.7 Real-time PCR引物  18  1.2 实验方法  18-29    1.2.1 MicroRNA的real-time PCR  18-20    1.2.2 原位杂交  20-21    1.2.3 重组腺病毒穿梭质粒的构建  21-23    1.2.4 分子克隆  23-25    1.2.5 腺病毒表达载体表达产物的鉴定  25-29第二章 实验结果  29-41  2.1 小鼠胚胎肺发育过程中let-7家族成员的表达检测  29-30  2.2 小鼠胚胎肺发育过程中let-7a、let-7d的表达模式检测  30-31  2.3 重组腺病毒穿梭载体的构建  31-41    2.3.1 pDC316-mCMV-mK-ras腺病毒穿梭载体的构建  31-32    2.3.2 pDC316-CMV腺病毒穿梭载体的构建  32-33    2.3.3 pDC316-CMV-control腺病毒穿梭载体的构建  33-34    2.3.4 pDC316-CMV-let-7a腺病毒穿梭载体的构建  34-35    2.3.5 重组腺病毒穿梭载体的表达鉴定  35-41第三章 分析与讨论  41-45  3.1 let-7家族成员在小鼠胚胎肺发育过程中的表达变化  41-42  3.2 腺病毒穿梭质粒的构建及其在人和小鼠细胞的功能研究  42-45第四章 结论  45-49  4.1 let-7miRNA在小鼠胚胎发育过程中的表达  45  4.2 重组腺病毒穿梭质粒的构建及其检测  45-46    4.2.1 成功构建分别携带三种目的基因的腺病毒穿梭质粒  45    4.2.2 mK-ras、let-7a在mRNA水平上有表达  45-46    4.2.3 在蛋白质水平上检测mK-ras的表达,let-7a与mK-ras之间存在负调控关系  46    4.2.4 let-7与mK-ras之间的负调控关系发生于翻译水平上  46  4.3 研究展望  46-49附录1 质粒图谱  49-51附录2 测序报告单  51-55附录3 英文缩略语表  55-57参考文献  57-63攻读学位期间承担的科研任务与主要成果  63-65致谢  65-67个人简历  67-69

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中图分类: > 生物科学 > 分子生物学 > 基因工程（遗传工程）
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