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抗水产病原菌海洋放线菌菌株DL-4的鉴定、发酵优化及其生物学特性研究

作　者: 王勇
导　师: 王高学
学　校: 西北农林科技大学
专　业: 化学生物学
关键词: 海洋放线菌链霉菌鉴定发酵条件优化纯化
分类号: S917.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

对分别采自大连近海岸、山东日照近海岸、海南海口近海海泥样品,陕西后河、西安温泉的泥土样品,采用稀释平板法分离、纯化,共分离到放线菌90株。采用琼脂扩散法和平板孔阱扩散法,以大肠杆菌(Eschenchia coli)、金黄葡萄球菌(Staphlococcus aureus)、肠型点状产气单胞菌(Aeromonas punctata f.instestinalis)、鳗弧菌(Vibrio anguillarum)、嗜水气单胞菌(Aeromonas hydrophila)为测试菌,进行抗菌活性菌种筛选,筛选出一株具有抗菌谱广、活性较强的放线菌DL-4。通过对DL-4的16S rDNA序列测定,与GenBank数据库中的16S rDNA序列进行比对,其同弗氏链霉菌(Streptomyces rubrolavendulae)相似,系统进化树分析表明二者之间的进化距离相隔较近,结合放线菌DL-4的形态特征、培养特征及生理生化特性,将其确定为弗氏链霉菌(Streptomyces fradiae)。为了提高抗菌物质的产量,对菌株发酵培养基组分和发酵条件进行优化。采用平板孔阱扩散法测发酵液的活性,确定培养基最佳组成为可溶性淀粉10g/L,蛋白胨5g/L;发酵条件优化结果表明最适起始pH8.0,最适接种量为5%,最适培养温度为37℃,最适培养时间96h。通过实验可知海洋放线菌DL-4的原始发酵液相当于庆大霉素的效价为75.469μg/mL。菌株DL-4发酵液对大肠杆菌的MIC值和MBC值分别为9.43μg/mL和18.87μg/mL。本实验对代谢产物稳定性进行了研究,结果表明发酵液中的抑菌活性物质具有一定的遗传稳定性,酸碱稳定性和热稳定性较强,在自然光和紫外光下稳定,在4℃和室温条件下贮藏也较稳定。根据捷克八溶剂系统纸层析鉴定结果,初步确定菌株DL-4抗菌活性物质可能是多烯类抗生素。通过活性追踪实验,对链霉菌DL-4菌株发酵液的预处理、旋转蒸发仪浓缩、有机溶剂萃取、D201型树脂吸附、聚酰胺柱层析、葡聚糖凝胶和反相柱洗脱,获得抑菌活性物质粗品。

全文目录

摘要  5-6
ABSTRACT  6-11
第一章文献综述  11-22
  1.1 海洋放线菌的研究概况  11-14
    1.1.1 海洋放线菌的分布  11-13
    1.1.2 海洋放线菌的生物活性物质  13-14
  1.2 放线菌的分类  14-17
    1.2.1 多相分类方法  14-16
    1.2.2 放线茵分类学研究的发展趋势  16-17
  1.3 抗生素的筛选途径  17-20
    1.3.1 生态学途径  17-18
    1.3.2 遗传学途径  18-20
  1.4 抗生素在水产养殖上的应用  20
  1.5 本研究的目的和意义  20-22
第二章具有抗菌作用的海洋放线菌的分离、纯化及鉴定  22-33
  2.1 材料与方法  22-23
    2.1.1 土样的采集  22
    2.1.2 供试靶标菌  22
    2.1.3 培养基  22-23
  2.2 抗菌物质产生菌的筛选  23-24
    2.2.1 样品稀释液的制备  23
    2.2.2 海洋放线菌的分离  23-24
    2.2.3 放线菌菌株的纯化  24
    2.2.4 抗菌放线菌的筛选  24
  2.3 菌株保藏  24
    2.3.1 斜面保种  24
    2.3.2 甘油水溶液保种  24
  2.4 放线菌鉴定  24-28
    2.4.1 供试菌株活化  24-25
    2.4.2 放线菌初步鉴定  25-27
    2.4.3 16SrDNA 序列分析  27-28
  2.5 结果与分析  28-31
    2.5.1 抗菌物质产生菌的筛选  28-29
    2.5.2 DL-4 的形态与培养特征  29-30
    2.5.3 生理生化鉴定结果  30
    2.5.4 碳源的利用  30-31
    2.5.5 分子鉴定结果  31
  2.6 讨论  31-32
  2.7 小结  32-33
第三章菌株DL-4 产抗菌物质的发酵条件优化研究  33-42
  3.1 材料  33-34
    3.1.1 菌株  33
    3.1.2 培养基  33-34
    3.1.3 仪器设备与试剂  34
  3.2 方法  34-36
    3.2.1 菌株 DL-4 的接种  34
    3.2.2 菌种复壮  34
    3.2.3 菌株 DL-4 的原始摇瓶培养条件  34
    3.2.4 菌株 DL-4 基础发酵培养基筛选  34
    3.2.5 发酵培养基的优化  34-35
    3.2.6 发酵条件的优化  35-36
    3.2.7 菌株DL-4 在最优发酵条件下的生长周期测定  36
  3.3 结果  36-39
    3.3.1 菌株 DL-4 基础发酵培养基筛选结果  36
    3.3.2 发酵条件培养基的优化  36-38
    3.3.3 发酵条件的优化  38-39
    3.3.4 菌株 DL-4 的生长曲线  39
  3.4 讨论  39-40
  3.5 小结  40-42
第四章菌株DL-4 活性物质部分理化性质的研究  42-52
  4.1 材料  42
    4.1.1 菌株  42
    4.1.2 培养基  42
    4.1.3 菌株 DL -4 发酵液的制备  42
  4.2 方法  42-46
    4.2.1 庆大霉素标准曲线的绘测和发酵液效价测定  42-43
    4.2.2 发酵液体外最小抑菌浓度 MIC 和最小杀菌浓度 MBC 的测定  43
    4.2.3 抗菌谱测定  43
    4.2.4 菌株及发酵产物稳定性研究  43-44
    4.2.5 发酵液中活性物质的 Doskochilova 溶剂系统鉴定  44
    4.2.6 还原糖含量  44-46
  4.3 结果  46-50
    4.3.1 活性物质含量测定的标准曲线  46
    4.3.2 发酵液MIC 值和MBC 值  46-47
    4.3.3 抑菌谱测定结果  47
    4.3.4 菌株及发酵产物稳定性  47-49
    4.3.5 菌株 DL-4 活性物质的 Doskochilova 溶剂系统鉴定  49-50
    4.3.6 还原糖含量  50
  4.4 讨论  50-51
  4.5 小结  51-52
第五章海洋微生物菌株DL-4 发酵产物的初步分离  52-59
  5.1 材料  52
    5.1.1 菌株  52
    5.1.2 主要试剂  52
  5.2 方法  52-55
    5.2.1 发酵液的制备及预处理  52
    5.2.2 发酵液抗菌活性物质萃取及提取试验  52-53
    5.2.3 活性物质树脂吸附试验  53-54
    5.2.4 聚酰胺柱层析  54
    5.2.5 凝胶柱层析(Sephadex LH-20)  54-55
    5.2.6 C18 柱层析  55
  5.3 结果与分析  55-57
    5.3.1 六种树脂的静态吸附解吸结果  55-56
    5.3.2 洗脱剂的选择  56
    5.3.3 D201 大孔吸附树脂的洗脱结果  56
    5.3.4 聚酰胺柱层析结果  56-57
    5.3.5 葡聚糖凝胶的分离纯化  57
    5.3.6 组分Fr.4 的C18 柱层析分离纯化结果  57
  5.4 讨论  57-58
  5.5 小结  58-59
第六章结论  59-60
参考文献  60-65
致谢  65-66
作者简介  66

抗水产病原菌海洋放线菌菌株DL-4的鉴定、发酵优化及其生物学特性研究

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