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合浦珠母贝遗传选育及两种免疫基因研究

作　者: 郭华阳
导　师: 江世贵
学　校: 上海海洋大学
专　业: 水产养殖
关键词: 合浦珠母贝家系生长性状壳色选系遗传力过氧化物酶抗菌肽基因克隆表达分析蛋白纯化抑菌活性
分类号: S917.4
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

合浦珠母贝（Pinctada fucata）又称马氏珠母贝，是世界上培育海水珍珠的主要种类之一，在我国主要分布于广东、广西、海南及台湾省沿海，我国合浦珠母贝所产珍珠即为国际上享誉盛名的“南珠”。海水珍珠养殖产业是我国华南沿海地区的特色经济支柱产业之一。近年来，由于海区污染、养殖病害频发和种质资源衰退，致使养殖合浦珠母贝出现了死亡率高、生长缓慢等现象，造成了巨大的经济损失，成为制约海水珍珠养殖产业可持续发展的技术瓶颈之一。因此，急需开展合浦珠母贝遗传选育和分子免疫调控机制研究，培育具有优良性状的新品种，发展新的免疫防治策略，促进合浦珠母贝养殖产业的健康发展。本研究在前期选育的基础上，以F3代不同壳色品系合浦珠母贝为亲本，构建了F4代不同壳色选育家系，利用全同胞家系评价了生长性状的遗传力水平；筛选克隆了合浦珠母贝过氧化氢酶（Catalase，PoCAT）和抗菌肽theromacin（antimicrobial peptides，PoAP）基因，研究了其组织表达和调控模式，检测了重组抗菌肽的抗菌活性，证实了其对革兰氏阴性菌具有强烈的抑菌作用，而对革兰氏阳性菌无抑菌作用。具体结果如下：1、合浦珠母贝壳色家系的建立及生长性状的比较采用雌雄单个配对，成功建立合浦珠母贝壳色全同胞家系20个。对其6个月龄的生长性状进行了比较，结果表明，BSF4-3、RSF4-1、RSF4-2和RSF4-5具有明显的生长优势，可作为进一步定向培育生长快速、个体大的合浦珠母贝的材料。壳宽系数的比较发现，BSF4-3壳宽系数最大，RSF4-5、WSF4-2、WSF4-3则次之。RSF4-1与RSF4-2相对较低。对不同壳色选系生长比较发现红色选系和黑色选系存在明显的生长优势，显著性大于其他壳色选系。其次为金色选系，而白色选系的生长最慢。2、合浦珠母贝幼体生长性状的遗传力及其相关性分析以海南陵水新村港养殖的金壳（Gp）、黑壳(Bp)、白壳（Wp）和红壳（Rp）合浦珠母贝不同壳色选育群体为亲贝，采用雌雄单个配对和人工授精的方法，获得金壳家系4个，黑壳家系5个，白壳和红壳家系各3个。分别在受精后5天、15天、25天和40天，从各个家系中随机取样50个幼体，测量其壳长及壳高，利用方差分析比较壳色系的生长差异。同时利用非求导约束最大似然法(DF-REML)，对合浦珠母贝在5、15、25、40日龄下的壳长和壳高性状进行遗传参数的估计。结果表明，实验期间，4种壳色系的平均壳长和壳高均存在显著性差异（p<0.05），40个日龄下，白色选系均具有最大壳长及壳高，金色选系均存在最小壳长和壳高。5～40日龄幼体壳高狭义遗传力估计值为0.17～0.23，壳长狭义遗传力估计值为0.12～0.22。合浦珠母贝幼体不同生长时期壳高和壳长的遗传相关和表型相关均为正相关，相关系数的范围分别为0.825～0.989，0.832～0.965，表明以壳高或壳长为参数进行选育时，均可达到改良生长性状的效果。3、合浦珠母贝过氧化氢酶基因特征和表达分析过氧化氢酶（Catalase）是机体内一类重要的抗氧化酶，能保护细胞免受活性氧的破坏，在生物体抗氧化能力以及免疫防御方面起到重要作用。本文研究了合浦珠母贝过氧化氢酶基因结构特征和在应激状态下的表达调控机制，合浦珠母贝过氧化氢酶基因PoCAT的cDNA序列全长为2428bp，其中5’-UTR为140 bp，3’-UTR为749 bp，ORF为1539 bp，可编码512个氨基酸，分子量大约为58.05 kDa，等电点为8.4。序列分析显示，在3’-UTR区含3个RNA不稳定信号结构域（ATTTA）和一个位于polyA上游18 bp处的加尾信号AATAAA。预测的氨基酸序列不含信号肽，说明该蛋白可能为胞内蛋白。PoCAT中存在CAT家族的签名序列350RLFSYSDT358、活性位点序列60FNRERIPERVVHAKGAGA78、12个NADPH潜在的结合位点（N145, H191, F95,S198, R200, N210,Y212, K234, I299,W300, H302,Y355）、两个N糖基化位点N436YS438、N478FS480以及三个催化位点His72, Asn145和Tyr355。利用MatGAT软件对PoCAT氨基酸序列和其它物种CAT序列进行同源性和相似性分析，结果表明PoCAT与其它物种CAT序列具有较高的保守性，同源性为62.3%-82.2%，相似性为73%-92%。组织表达模式分析表明PoCAT mRNA在消化腺、鳃、性腺、肠和外套膜中都有表达。免疫应激实验结果显示，在2 h、4 h和12h时PoCAT基因在肠中的表达显著上调，表明PoCAT可能参与了合浦珠母贝的先天免疫应答反应。4、合浦珠母贝抗菌肽theromacitheromacin的基因克隆及原核表达抗菌肽是生物体产生的一类多肽，具有分子量小，热稳定，水溶性好，无免疫原性，抗菌谱广等特点，对真菌、细菌等病原微生物具有抑制或杀灭作用，通常被称为“第二防御体系”。Theromacin是一类已被证实有抗微生物作用的抗菌肽，在机体的免疫系统中起着重要的作用。合浦珠母贝的抗菌肽theromacin基因(PoAP)全长522 bp，其中5’-UTR为6bp，3’-UTR为141 bp，ORF为375 bp，可编码124个氨基酸，分子量大约为13.67 kDa，等电点为9.25。序列分析显示，在3’-UTR区含1个RNA不稳定信号结构域（ATTTA）和位于polyA上游18 bp处的一个典型的polyA加尾信号AATAAA。推导的多肽包括信号肽和成熟肽两个部分，根据SignalP 3.0在线软件推断出信号肽的切割位点在Gla33和Trp34之间，产生含有33个氨基酸的信号肽；预测成熟肽分子量为9889.4D，等电点Ip9.14，含有12个Cys结构，13个碱性氨基酸残基Arg和Lys。经TMpred在线软件分析出PoAP存在一个跨膜螺旋结构，在Val13到Ser34之间，表明PoAP是一个跨膜蛋白。利用MatGAT软件对PoAP氨基酸序列与其它已知theromacin序列分析显示PoAPtheromacin与其它已知theromacin序列的相似性为29.0–46.8%。构建进化树结果，显示PoAP与其他物种的theromacin聚类到一起。将该基因定向克隆到原核表达载体pET-32α中，在大肠杆菌BL21中成功表达出带His-tag的融合蛋白，分子量约为31 kDa，大小与预期一致。对重组蛋白进行纯化，并利用纯化的蛋白对革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌的抑菌效果进行了比较。结果表明，合浦珠母贝theromacin蛋白对革兰氏阴性菌存在明显的溶菌效果，而对革兰氏阳性菌没有抑菌活性。这说明合浦珠母贝抗菌肽theromacin对病原微生物的抗菌作用存在选择性。

全文目录

摘要  4-7
ABSTRACT  7-12
引言  12-13
第一章、文献综述  13-33
  1、合浦珠母贝概述  13-14
  2、合浦珠母贝资源现状  14
  3、合浦珠母贝遗传育种研究现状  14-17
  4、合浦珠母贝壳色选育研究进展  17-22
  5、遗传相关参数的研究进展  22-27
  6、贝类免疫学研究进展  27-31
  7、贝类过氧化氢酶研究进展  31-33
第二章、合浦珠母贝壳色家系的建立及生长比较  33-48
  一、前言  33-34
  二、材料和方法  34-36
  三、结果与分析  36-46
  四、讨论  46-48
第三章、合浦珠母贝幼体生长性状的遗传力及其相关性分析  48-56
  一、前言  48
  二、材料和方法  48-50
  三、结果与分析  50-54
  四、讨论  54-56
第四章、合浦珠母贝过氧化氢酶基因特征和表达分析  56-77
  一、前言  56-57
  二、材料与方法  57-64
  三、结果与分析  64-75
  四、讨论  75-77
第五章、合浦珠母贝抗菌肽theromacin 的基因克隆及原核表达  77-106
  一、前言  77-78
  二、材料与方法  78-90
  三、结果与分析  90-104
  四、讨论  104-106
小结  106-108
参考文献  108-120
附录  120-121
致谢  121

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