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大米抗氧化活性肽的分离纯化和性质研究

作　者: 申衍豪
导　师: 刘芳
学　校: 中南林业科技大学
专　业: 食品科学
关键词: 大米抗氧化活性肽响应面优化体外模拟实验分离和纯化
分类号: TS210.1
类　型: 硕士论文
年　份: 2011年
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内容摘要

自从Harman提出自由基理论以来,人们认识到人体内氧化产生的自由基与人体衰老和许多疾病有关,因此人们越来越关注抗氧化剂。但目前大多数抗氧化剂都是化学合成物,如叔丁基羟基茴香醚(BHA)、二丁基羟基甲苯(BHT)；这些化学类抗氧化剂虽然效果好,但是对人体具有潜在毒性。近年来,人们把目光转到天然性的抗氧化剂,如抗坏血酸、α-生育酚、茶多酚、大豆蛋白酶解得到的大豆肽等。近年来研究发现,大米源抗氧化活性肽(antixox-idative peptide)也具有较强的抑制生物大分子过氧化和清除体内自由基的功能,而且这些抗氧化活性肽往往强于蛋白质和氨基酸,并且具有低毒、高效等特点,有望利用这些抗氧化活性肽开发新功能食品和保健品。本文对大米抗氧化活性肽的制备工艺进行了优化,通过响应面分析法优化了超声波处理工艺参数的最佳组合；通过不同的体外体系,研究大米碱性蛋白酶酶解产物的抗氧化活性,然后进一步分离和纯化,得到了几段抗氧化活性高的片段；并通过体外模拟人体消化,评价分析了消化对大米抗氧化活性肽抗氧化活性的影响。现将主要结果和结论归纳如下：1、选取超声功率、超声处理时间、超声处理初始温度做3因素3水平响应面分析实验,采用SAS程序对实验数据进行回归分析,得出模型中最佳提取工艺参数：超声功率1750W、超声处理时间30min、超声处理初始温度40℃,其DPPH·清除率预测可达到78.2%。对以上工艺参数进行验证实验,经3次平行测定,各抗氧化肽的DPPH·清除率分别为：76.0%、75.8%和77.4%,此时抗氧化肽的浓度分别为1.5037、1.5163和1.5085mg/mL, DPPH清除率的平均值为76.4%,抗氧化肽的平均浓度为1.5095mg/mL,实验结果较理想。在优化工艺条件下,抗氧化肽得率由31.6%提高到42.2%。2、本章采用了5种抗氧化活性检测的方法,其中包含了脂类物质氧化抑制能力的方法、清除自由基能力的方法和还原能力的测定方法,较全面地反映了大米多肽的抗氧化能力。并和Vc的抗氧化能力做了比较,在高浓度20.00～50.00mg/mL,大米多肽和Vc对·OH清除能力相当,但是在其他浓度和清除其他自由基的情况时,大米多肽的能力都低于Vc。总的来说,大米多肽的抗氧化能力在一定范围内,与浓度呈一定的量效比。3、使用葡聚糖凝胶SephadexG-25初步分离纯化后,发现分子量在132.7-1153.9的小肽占得相当大的比例,为下一步纯化分离打下了基础。4、利用SP-Sephadex C-25作为离子交换层析介质,pH4.0,0.02mol/LHAc-NaAc为起始缓冲液,流速120mL/h, NaCl(0～1mol/L)梯度洗脱,大米碱性蛋白酶水解产物NHREP得到了较好的分离,混合肽组分被分离出七个组分(A-G),组分F的DPPH·清除能力最强(80.09±1.22%)。5、利用Sephadex G-15凝胶色谱又将组分F分成了4个组分F1、F2、F3和F4。并分别检测了各组分的DPPH·清除能力。结果发现,组分F3表现出最强的DPPH·清除能力(达到77.64%)。组分F3经RP-HPLC分离后,分成五个主要组分,其中组分F3b的DPPH·清除能力最强,达到了89.53%；组分F3c次之,其对DPPH·的清除能力为76.21%。6、通过体外模拟人体消化过程,测定大米活性多肽清除DPPH·的能力,来评价体外模拟人体消化过程对大米多肽抗氧化能力影响的情况。经过人体模拟消化后,最后在透析液中,大米多肽清除DPPH·的清除率最高可以达到45.53%。这为后续大米多肽在体内实验提供了良好的基础,并建立了大米多肽体外模拟消化的实验流程图。

全文目录

摘要  4-6
ABSTRACT  6-11
1 绪论  11-23
  1.1 本课题的研究现状和选题依据  11-12
  1.2 本课题的研究意义  12
  1.3 大米蛋白  12-14
    1.3.1 大米蛋白组成及提取  12-13
    1.3.2 大米蛋白的理化性质  13
    1.3.3 大米蛋白的研究现状  13-14
  1.4 大米活性肽的作用概述  14-15
    1.4.1 具有抗氧化作用的活性肽  14
    1.4.2 具有抗高血压作用的活性肽  14-15
    1.4.3 具有类吗啡拮抗和免疫调节作用的活性肽  15
  1.5 大米抗氧化活性肽的特点及应用  15-18
    1.5.1 抗氧化活性肽简介  15
    1.5.2 肽的抗氧化机理  15-16
    1.5.3 抗氧化活性检测的研究进展  16
    1.5.4 抗氧化活性肽的主要来源及抗氧化效果  16-18
    1.5.5 大米抗氧化活性肽的特点  18
    1.5.6 大米抗氧化活性肽的应用前景  18
  1.6 大米抗氧化活性肽的制备方法  18-19
    1.6.1 原料的选择  18
    1.6.2 酶的选择  18-19
  1.7 多肽的分离纯化方法  19-22
    1.7.1 膜分离技术  20
    1.7.2 离子交换色谱  20
    1.7.3 疏水相互作用色谱  20
    1.7.4 凝胶过滤色谱  20-21
    1.7.5 亲和色谱  21
    1.7.6 反相高效液相色谱  21
    1.7.7 毛细管电泳  21
    1.7.8 产品纯度检验  21-22
  1.8 本课题的主要研究内容  22-23
2 酶解大米制备抗氧化活性多肽工艺优化研究及初步分离  23-33
  2.0 引言  23
  2.1 材料与方法  23-26
    2.1.1 材料  23-24
    2.1.2 方法  24-26
  2.2 结果与讨论  26-31
    2.2.1 籼米成分分析  26-27
    2.2.2 大米抗氧化肽得率的测定结果  27
    2.2.3 大米活性粗肽的DPPH·清除能力测定  27-28
    2.2.4 超声波预处理参数对酶解大米蛋白制备活性多肽的影响  28-31
  2.3 本章小结  31-33
3 大米抗氧化活性肽的抗氧化性研究  33-41
  3.0 引言  33
  3.1 材料与方法  33-36
    3.1.1 材料  33-34
    3.1.2 方法  34-36
  3.2 结果与讨论  36-39
    3.2.1 大米多肽还原能力的测定  36
    3.2.2 大米多肽对羟基自由基的清除作用  36-37
    3.2.3 大米多肽对超氧阴离子的清除作用  37
    3.2.4 大米多肽对DPPH·的清除作用  37-38
    3.2.5 大米多肽抑制亚油酸氧化能力的测定  38-39
  3.3 本章结论  39-41
4 大米抗氧化活性肽的分离纯化  41-51
  4.0 引言  41-42
  4.1 材料与方法  42-44
    4.1.1 材料  42
    4.1.2 方法  42-44
  4.2 结果与讨论  44-50
    4.2.1 大米多肽分子量分布的研究  44-46
    4.2.2 紫外光谱检测  46-47
    4.2.3 离子交换层析分离大米碱性酶解物  47-48
    4.2.4 凝胶色谱Sephadex G-15分离大米抗氧化活性肽  48-49
    4.2.5 半制备RP-HPLC分离大米抗氧化活性肽  49-50
  4.3 本章结论  50-51
5 体外模拟消化对大米抗氧化肽活性的影响  51-59
  5.0 引言  51
  5.1 材料与方法  51-54
    5.1.1 材料  51-52
    5.1.2 方法  52-54
  5.2 结果与讨论  54-57
    5.2.1 胃消化环境的确定  54-55
    5.2.2 肠吸收环境的确定  55-56
    5.2.3 大米多肽体外模拟消化的实验流程  56
    5.2.4 透析液与滞留液清除DPPH·能力的比较  56-57
  5.3 本章结论  57-59
6 结论及展望  59-63
  6.1 主要结论  59-60
  6.2 进一步的研究方向  60-61
  6.3 研究的创新点  61-63
参考文献  63-75
附录A 攻读学位期间的主要学术成果  75-76
致谢  76

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