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两个Ⅰ型聚酮合酶功能结构域在异源宿主的表达

作　者: 陶美凤
导　师: 邓子新
学　校: 华中农业大学
专　业: 生物化学与分子生物学
关键词: 聚酮合酶(PKS) PKS特异性抗体 异源表达 抗真菌抗生素 双功能表达载体
分类号: Q55
类　型: 博士论文
年　份: 1999年
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内容摘要


链霉菌FR-008聚酮合酶(PKS)基因簇负责七烯大环内酯抗真菌抗生素杀假丝菌素(FR-008)的生物合成，将这个巨大的基因簇转入植物以探索产生抗真菌植物品种的可能性是我们深入研究杀假丝菌素生物合成基因簇的长远目标之一。 为探索在植物中表达极高G+C含量的PKS基因的可能性，构建了携带有编码FR-008 Ⅰ型PKS模块氨基端部分的基因的表达质粒，包括一个酮基合酶(KS)和部分酰基转移酶(AT)活性结构域。该载体携带有花椰菜花叶病毒35S RNA的启动子以指导PKS的表达。由于载体中2.7 kb的PKS基因编码了两种酶活性的结构域而不是完整的Ⅰ型PKS模块，因此我们目前并不期望这个截短的PKS基因在植物能产生抗真菌活性。 为在大肠杆菌超量表达该2.7 kb PKS基因所编码的两个功能结构域，构建了具有不同启动子组合的PKS表达质粒。其中一些可超量表达具有预期分子量的PKS蛋白。进一步截短的基因可以表达预期大小的50 kDa蛋白，表明这些超量表达的蛋白是由克隆在质粒上的PKS基因所编码。 接着将大肠杆菌表达的PKS作为抗原制备与天然FR-008 PKS对应的多克隆抗体。蛋白质印迹实验显示，部分提纯的抗体样品与大肠杆菌中表达的PKS蛋白有特异性反应。同时，这些抗体也可与天然存在于链霉菌FR-008的、巨大的PKS蛋白特异性地反应。这说明构建的大肠杆菌表达质粒中FR-008 PKS基因是以正确的读码框架克隆和表达的；同时也表明抗血清对天然的FR-008 Ⅰ型PKS具有特异性。利用抗体检测PKS的检出极限比考马斯亮蓝染色高1000倍，应可用于检测植物中低水平的PKS表达。 构建了两个链霉菌-大肠杆菌双功能PKS表达质粒，在重组PKS基因上游携带有λ噬菌体启动子。利用这些质粒在变铅青链霉菌和大肠杆菌中均表达出PKS蛋白，两种宿主中的表达都是热依赖的。暗示λ噬菌体启动子和温敏型λ阻遏物在变铅青链霉菌和大肠杆菌中都具有功能。表达PKS的变铅青链霉菌菌株在孢子形成和抗生素产生方面与没有2.7 kb PKS基因的菌株相比较是有区别的，因而推测在链霉菌中表达的双功能结构域PKS蛋白具有活性。 构建了带有λ噬菌体启动子和特异性抗原决定簇(表位)及2.7 kb PKS基因的整合型质粒，用于标记天然的FR-008 PKS。将这些质粒转入链霉菌FR-008的限制性缺陷菌株中得到抗性转化子。Southern杂交证实2.7 kb PKS基因和天然PKS基因之间通过同源重组发生了整合。衍生菌株合成抗真菌抗生素的产量与亲本菌株不同，表明FR-008基因的原始启动子已被改造后的启动子和抗原决定簇所代替。 根据受cIts857调控的P_R能引导PKS基因的成功表达，构建了大肠杆菌表达载体pHZ330以及在大肠杆菌和链霉菌两种宿主中都能表达外源基因的双功能表达载体pHZ1060。两种载体在宿主细胞中是稳定的，应可用于异源基因的表达。

全文目录


目录  3-6
中文摘要  6-7
英文摘要  7-9
缩略词表  9-11
1 文献综述  11-39
  1.1 聚酮和杂合抗生素  11-19
    1.1.1 抗生素简介  11-12
    1.1.2 聚酮类抗生素  12-16
    1.1.3 聚酮的组合合成  16-18
    1.1.4 杀假丝菌素(FR-008)PKS基因簇  18-19
  1.2 以大肠杆菌和链霉菌为宿主的异源基因表达  19-30
    1.2.1 在细菌中的基因表达和调节简介  20
    1.2.2 转录起始的调节是最主要的调节  20-24
    1.2.3 大肠杆菌异源表达系统  24-26
    1.2.4 以链霉菌为宿主的异源基因表达  26-30
  1.3 以植物为宿主的异源表达简介  30-33
    1.3.1 植物病虫害及转基因改良植物简介  30-32
    1.3.2 植物和真细菌的基因表达差异简介  32
    1.3.3 植物异源表达的宿主-载体系统  32-33
  1.4 与本论文有关的前期工作  33-38
    1.4.1 链霉菌FR-008的PKS可能是多功能的巨大蛋白质  33
    1.4.2 与FR-008合成有关的PKS基因的克隆及部分测序  33-34
    1.4.3 pHZ317，一个用于表达FR-008 PKS基因的pET-15b衍生物  34
    1.4.4 pHZ317仅产生很低量的100kDa PKS蛋白  34-38
    1.4.5 带有pHZ317的大肠杆菌不超量表达PKS蛋白的可能原因  38
  1.5 本论文的研究目的和意义  38-39
2 材料与方法  39-47
  2.1 材料  39-43
    2.1.1 菌株  39-40
    2.1.2 质粒  40-42
    2.1.3 培养基  42-43
    2.1.4 酶及化学试剂  43
  2.2 方法  43-47
    2.2.1 大肠杆菌质粒提取方法  43
    2.2.2 大肠杆菌转化子的快速检测  43
    2.2.3 链霉菌总DNA的提取  43-44
    2.2.4 以大肠杆菌为宿主的诱导表达  44
    2.2.5 以链霉菌为宿主的表达  44
    2.2.6 链霉菌总蛋白的SDS-PAGE分析  44
    2.2.7 包含体蛋白的提纯  44-45
    2.2.8 抗体制备  45
    2.2.9 Western杂交  45-46
    2.2.10 抗生素FR-008的生物测定  46-47
3 结果与分析  47-103
  3.1 用于在大肠杆菌中表达聚酮合酶(PKS)基因的质粒构建  47-56
    3.1.1 引言  47
    3.1.2 pHZ1051，一个携带有串联的P_R、P_L和P_(T7)的表达质粒  47-49
    3.1.3 pHZ1053，一个包含P_R和P_L但缺乏P_(T7)的表达质粒  49-50
    3.1.4 pHZ1052，一个具有P_R和P_(T7)但缺乏P_L的表达质粒  50
    3.1.5 pHZ1056，包含P_(T7)和一个PKS基因下游转录终止子的表达质粒  50-52
    3.1.6 包含较短PKS基因片段的表达质粒  52-53
    3.1.7 PKS表达质粒的比较  53-56
  3.2 两个Ⅰ型聚酮合酶(PKS)功能结构域在大肠杆菌中的表达  56-66
    3.2.1 下游的转录终止子并未使P_(T7)过量表达PKS  56-57
    3.2.2 用BL21(DE3)得到比BL21(DE3)(pLysS)更高而且重复性更好的表达  57
    3.2.3 串联的P_R和P_L使PKS蛋白得到低量表达  57-58
    3.2.4 组合的P_R、P_L和P_(T7)使两种大小的PKS蛋白均超量表达  58
    3.2.5 过量表达的PKS蛋白在大肠杆菌中形成包含体  58
    3.2.6 P_R和P_(T7)的组合使PKS超量表达  58-62
    3.2.7 对P_R、P_(T7)的双重诱导反而降低了PKS表达  62
    3.2.8 较短的1.3 kb的PKS基因并不总是比2.7 kb的PKS基因表达水平高  62-63
    3.2.9 小结  63-66
  3.3 FR-008聚酮合酶(PKS)特异性抗体  66-71
    3.3.1 引言  66
    3.3.2 免疫扩散  66-67
    3.3.3 通过Western杂交鉴定抗体  67-68
    3.3.4 利用Western印迹检测链霉菌FR-008衍生菌株PKS蛋白  68-71
  3.4 两个Ⅰ型聚酮合酶(PKS)功能结构域在变铅青链霉菌中的诱导表达  71-81
    3.4.1 引言  71
    3.4.2 常用的tipA启动子或ermE启动子不能在链霉菌中表达PKS蛋白  71-73
    3.4.3 带SCP2~*复制子的低拷贝表达质粒pHZ1065和pHZ1067的构建  73
    3.4.4 带pIJ101复制子的高拷贝表达质粒pHZ1068的构建  73-76
    3.4.5 PKS在双功能质粒pHZ1065、pHZ1067、pHZ1068的表达  76-78
    3.4.6 双结构域PKS的低水平表达引起宿主变铅青链霉菌ZX64表型变化  78-80
    3.4.7 小结  80-81
  3.5 启动子置换与链霉菌FR-008 PKS-ORF1的表位标记  81-94
    3.5.1 引言  81-82
    3.5.2 把HA表位标签插入2.7 kb的PKS基因  82-84
    3.5.3 带表位标签和P_R-cIts857或者ermEP_1P_2的5个整合质粒的构建  84-88
    3.5.4 整合质粒转化链霉菌DX600  88
    3.5.5 转化子的鉴定  88-93
    3.5.6 小结  93-94
  3.6 两个大肠杆菌和链霉菌表达载体的构建  94-99
    3.6.1 引言  94
    3.6.2 大肠杆菌表达载体pHZ330的构建  94-96
    3.6.3 可用相同的表达盒在链霉菌和大肠杆菌进行表达的双功能表达载体  96
    3.6.4 小结  96-99
  3.7 一个旨在植物中表达PKS的质粒的构建  99-103
    3.7.1 引言  99
    3.7.2 pHZ321的构建  99-102
    3.7.3 小结  102-103
4 总结和讨论  103-106
参考文献  106-115
致谢  115

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中图分类: > 生物科学 > 生物化学 > 酶
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