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Peroxiredoxin Ⅱ在肝癌组织中的表达及功能分析

作　者: 岳海英
导　师: 李瑗；刘银坤
学　校: 广西医科大学
专　业: 肿瘤学
关键词: 硫氧还原蛋白过氧化物酶Ⅱ 肝细胞性肝癌黄曲霉毒素B1 树鼩 RNA干扰
分类号: R735.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2007年
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内容摘要

目的动态观察黄曲霉毒素B₁（Aflatoxin B₁,AFB₁）诱发树鼩肝癌发生过程中硫氧还原蛋白过氧化物酶Ⅱ（PeroxiredoxinⅡ,PrxⅡ）蛋白的表达情况,同时在人肝癌、癌旁组织及正常肝组织中进行验证,并进一步探讨PrxⅡ的生物学功能及其在肝癌发生发展中的作用机制。方法应用RT-PCR和Western blot方法,检测6例AFB₁诱发的树鼩肝癌、癌旁组织和这些动物肝癌发生前的活检肝组织,同时检测6例对照组动物相应时期的肝活检组织中PrxⅡ在mRNA水平和蛋白水平的表达改变,并在18例人肝癌及其相应癌旁组织和17例正常人肝组织进行验证,以及在三种人肝癌细胞系Hep3B、SMMC7721、MHCC97L和正常肝细胞系LO2中验证。然后化学合成针对PrxⅡ的小干扰RNA（siRNA）即PrxⅡ-1和PrxⅡ-2,分别用脂质体Lipofectamine^TM2000介导转染到人肝癌细胞系Hep3B细胞,应用荧光定量PCR和Western blot测定干扰效果,再通过MTT实验、细胞周期实验、细胞克隆形成实验、细胞凋亡检测等,观察PrxⅡ表达被干扰后对Hep3B细胞生物学功能的影响;最后通过二氛荧光素双乙酸（Dichlorodihydrofluoresceindiacetate,DCFH-DA）法和硫代巴比妥酸（Thibabituric acid,TBA）法检测细胞内过氧化代谢产物活性氧类（Reactive oxygen species,ROS）和脂质过氧化产物丙二醛（Malondialdehyde,MDA）的水平来探讨PrxⅡ的作用机制。结果1.PrxⅡ在树鼩肝癌组织中的mRNA和蛋白水平表达均明显高于相应的癌旁和癌前组织,也高于对照组同期活检肝组织（均为P＜0.05）;人肝癌组织中PrxⅡ的mRNA和蛋白表达改变和树鼩相符,即肝癌中的表达高于癌旁组织和正常肝组织（均为P＜0.05）;人肝癌细胞系Hep3B、SMMC7721、MHCC97L中的mRNA和蛋白表达水平也高于正常肝细胞系LO2（均为P＜0.01）。2.PrxⅡ-siRNA瞬时转入Hep3B细胞后,细胞中PrxⅡ的mRNA和蛋白表达均受到抑制,转染48h后PrxⅡmRNA水平抑制率达80%以上。3.以空白对照组（未经转染的Hep3B细胞）、阴性对照组（转染非特异性dsRNA）和分别转染两对siRNA的实验组,即PrxⅡ-1组和PrxⅡ-2组进行一系列实验,结果为实验组Hep3B细胞的生长受到不同程度的抑制,抑制率在转染96h后可达40%以上（P＜0.05）,并且细胞生长状态较差,阴性对照组和空白对照组细胞生长无明显变化。PrxⅡ-1和PrxⅡ-2组、阴性对照组及空白对照组的细胞周期各时相的比例变化不大;RNA干扰PrxⅡ表达后,Hep3B细胞凋亡比例明显增加:2个实验组及阴性对照组、空白对照组的细胞凋亡比例在转染终浓度为50nmol/L时分别为8.40%、7.59%、5.14%和4.91%,在转染终浓度为100nmol/L时分别为19.40%、33.25%、5.96%和4.91%;以上4组PrxⅡ表达降低后细胞克隆形成数明显下降,各组分别为42.0±2.83、40.5±0.71、121.5±2.12和130.0±1.41（两个实验组与阴性对照组、空白对照组相比,均为P＜0.05）,并且两个实验组形成的克隆直径也小于空白组和阴性对照组。4.DCFH-DA法和TBA法检测结果显示细胞内ROS和MDA的水平在两个实验组明显高于两个对照组（均为P＜0.05）。结论PrxⅡ在树鼩和人癌组织中的表达均高于相应的癌旁、癌前和正常肝组织,在肝癌细胞系中的表达高于正常肝细胞系;PrxⅡ的生物学功能涉及细胞生长与凋亡、细胞克隆形成能力及细胞内过氧化产物代谢的影响。这些结果提示PrxⅡ在肝癌的发生发展过程中可能起重要作用,其机制可能与提高细胞内过氧化代谢产物ROS和MDA的水平形成有利于肿瘤细胞生长的微环境有关。因此,PrxⅡ有可能成为预防或治疗肝癌的分子靶标。

Peroxiredoxin Ⅱ在肝癌组织中的表达及功能分析

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