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YB-1蛋白调节K562细胞中mdr1基因诱导性表达的研究

作　者: 罗文娟
导　师: 许文林
学　校: 江苏大学
专　业: 内科学
关键词: Y-盒结合蛋白1 多药耐药 P糖蛋白 MAPK/ERK信号通路 RNA干扰 转录调控
分类号: R733.7
类　型: 硕士论文
年　份: 2008年
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内容摘要


目的:1.用化疗药物阿霉素(doxorubicin,DOX)作用于白血病细胞K562,诱导多药耐药基因mdr1表达,检测Y-盒结合蛋白1(YB-1)基因和蛋白表达情况及其核易位情况。初步探讨YB-1蛋白与mdr1基因诱导性表达的关系。2.运用RNA干扰技术,使K562细胞中YB-1基因表达沉默,检测YB-1基因沉默前后K562细胞中mdr1基因诱导性表达的差异。3.研究阿霉素诱导K562细胞mdr1基因表达过程中,MAPK/RK信号通路对于YB-1核易位,调节mdr1基因表达的作用。方法:1.剂量逐渐递增的阿霉素长期作用于K562细胞,逆转录多聚酶链反应(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)方法检测YB-1、mdr1基因表达改变情况,流式细胞仪(flowcytometry,FCM)检测各组细胞mdr1基因编码的P-糖蛋白(P-glycoprotein,P-gp)的表达水平,Western blotting法检测诱导mdr1基因表达过程中YB-1蛋白表达及其核易位的变化情况。2.采用脂质体介导的方法将分别携带有三种人YB-1基因特异性shRNA及随机片段HK的真核表达载体(pGenesi1-1/YBX11、pGenesi1-1/YBX12、pGenesi1-1/YBX13、pGenesi1-1/HK)转染进K562细胞中,G418抗性筛选两周后获得阳性克隆。RT-PCR和Western blotting法分别检测这四组细胞和K562细胞中YB-1 mRNA和蛋白表达量的差异。取YB-1基因干扰效果最好的细胞株进行后续实验,以转染随机片段HK的细胞株(K562/HK)为对照组。RT-PCR及FCM分别检测YB-1基因干扰前后阿霉素诱导K562细胞mdr1基因和P-gp表达的差异。3.运用MAPK抑制剂PD98059预处理K562细胞一小时后,加入阿霉素共同作用(诱导方法同1)。RT-PCR检测mdr1,YB-1基因表达的情况,FCM检测P-gp的表达情况,Western blotting法检测ERK蛋白及其磷酸化情况,YB-1蛋白表达及其核易位的变化。结果:1.随着阿霉素作用浓度的增加,时间的延长,K562细胞mdr1基因表达逐渐上调,0.03μg/mL阿霉素作用24h就可以诱导mdr1及其编码的P-gp的表达,同时YB-1基因和蛋白表达均增加,并且出现明显的核易位。相关性分析显示YB-1核易位与mdr1基因的转录,P-gp的表达呈正相关。2.通过脂质体介导的方法将YB-1 shRNA和HK重组载体转染进K562细胞,G418筛选2周获得阳性克隆,依次为K562/HK、K562/Y1、K562/Y2、K562/Y3。流式细胞仪检测显示,重组质粒均获得较高转染率,四组细胞转染率依次为(73.48±1.19)%、(52.46±1.23)%、(62.67±1.16)%、(57.25±1.31)%;RT-PCR结果显示,K562/Y1和K562/Y3两组细胞YB-1基因表达量明显降低,K562/Y2略有减少。K562、K562/HK、K562/Y1、K562/Y2和K562/Y3五组细胞以β-actin标化后的YB-1灰度值分别为0.2613±0.026、0.2395±0.011、0.1523±0.016、0.2233±0.021和0.0866±0.015。YBX11、YBX12和YBX13对YB-1 mRNA的抑制率分别为(41.0±0.01)%、(13.3±0.12)%和(65.7±0.09)%;Western blotting结果也显示,K562/Y1和K562/Y3两组细胞YB-1的蛋白条带强度比对照组细胞明显减弱,说明YB-1shRNA的导入有效地抑制了目的基因的转录与蛋白的表达。以抑制效果最好的K562/Y3进行后续实验,K562/HK为对照排除转染的影响。RT-PCR检测显示K562/Y3组阿霉素诱导的mdr1基因表达明显弱于K562和K562/HK组,降低60%左右,FCM检测P-gp的表达也获得相似结果。提示YB-1蛋白参与了K562细胞mdr1基因的诱导性表达。3.Western blotting检测显示阿霉素作用于K562细胞后ERK磷酸化增强,MAPK/ERK信号通路被激活。用MAPK抑制剂PD98059预处理K562细胞后能有效抑制阿霉素诱导ERK磷酸化,同时阿霉素所诱导的YB-1蛋白核易位也被明显抑制,但对YB-1基因转录和表达没有影响。RT-PCR检测显示PD98059作用后阿霉素诱导的mdr1基因转录下降70%左右,FCM检测显示P-gp的表达也明显减少。因此MAPK/ERK信号通路参与了阿霉素所诱导的YB-1核易位和mdr1基因的表达。结论:阿霉素可以诱导K562细胞YB-1蛋白的表达,并促进其核易位,从而调控mdr1基因的表达,YB-1基因沉默后mdr1诱导性表达减少。进一步研究发现MAPK/ERK信号通路对阿霉素诱导YB-1蛋白核易位和mdr1基因表达起一定的作用,抑制ERK活化能有效阻断YB-1蛋白核易位,下调mdr1基因的诱导性表达。我们的研究揭示了阿霉素诱导mdr1基因表达的机制,为预防白血病多药耐药提供新的分子靶点。

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中图分类: > 医药、卫生 > 肿瘤学 > 造血器及淋巴系肿瘤 > 白血病
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