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HRP-3在肝癌组织中上调表达的生物学意义探讨

作　者: 孔亚慧
导　师: 赵寿元
学　校: 复旦大学
专　业: 遗传学
关键词: HRP-3 HDGF 肝癌血管形成细胞增殖 MAPK/ERK信号通路 SRE和E-box DNA反应元件 CRALBPL CRALBP CRAL-TRIO
分类号: R735.7
类　型: 博士论文
年　份: 2005年
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内容摘要

本文以我室已获得发明专利授权的HRP3(Hepatoma-derived growth factor related protein 3)基因为研究对象，对其功能进行了初步的研究。HRP3是HDGF(Hepatoma-derived growth factor)家族成员之一，它在正常情况下仅主要表达于人的睾丸，脑和心脏，其他组织中虽然也有表达，但表达很少。然而，我们发现，它在肝癌组织或肝癌细胞株中高丰度表达。为了探讨其在肝癌中高丰度表达的生理或病理学意义，我们用免疫组化方法证实它确在肝癌细胞中上调表达，且在肝癌组织内的血管或血管区的丰度最高。同时，我们用在哺乳动物中瞬时表达以及细菌中原核表达的方法检测了HRP-3是否能像HDGF那样可以分泌到细胞外，结果用HA或GST单克隆抗体在浓缩的培养基上清液中检测到了HA-HRP-3或GST-HRP-3融合蛋白，证明它确实能被分泌或释放到细胞外的培养基中。此外，EGFP-HRP-3的融合蛋白亚细胞定位分析结果又显示HRP-3能定位在核中，这些结果提示HRP-3具有分泌蛋白和核定位蛋白的双重特性。为了探讨HRP-3作为分泌蛋白的功能，我们用原核表达的HRP-3蛋白作为普通培养基的添加物质，分别培养成纤维细胞NIH3T3，人脐静脉内皮细胞HUVEC和肝癌细胞HepG2，其结果显示HRP-3蛋白在50-1000ng／mL浓度具有促生长因子的活性，尤其对于HUVEC细胞的促增殖作用最强，其次是NIH3T3细胞，对肝癌细胞也有明显的促增殖作用。这一结果提示HRP-3在肝癌组织中表达丰度显著上调，在病理学上具有促进瘤体内血管生长和肝癌细胞增殖的意义。基于上述发现，我们又进一步探讨了HRP-3促细胞生长的分子机制，结果显示当用50-1000ng／mL浓度的HRP-3重组蛋白作用于NIH3T3细胞，作用5-10min，可以使MAPK通路的MEK和ERK1／2蛋白激酶的磷酸化增强，而这种激活作用又能被MEK通路的特异抑制剂PD98059抑制，但对由P38和JNK激酶介导的通路则不受影响。为检查对MAPK通路的这种激活过程是否具有生理效应，我们又用双荧光素酶报告反应系统分别检查了MAPK通路下游的应答状态，结果显示，在外源重组蛋白HRP-3加入后的1-4h，SRE和E-box(C-Myc)元件下游的荧光素酶蛋白的表达增强，从而在分子水平说明HRP-3基因在肝癌中的上调表达所产生的促肿瘤生长作用，是通过细胞内和组织间隙HRP-3蛋白的增加，以增强血管内皮细胞和肝癌细胞内的MAPK信号来实现的。同时，我们还发现稳定表达外源HRP-3的细胞株显示出增殖或生长速度的加快，但其分子机制除了增加培养液中的HRP-3蛋白的分泌量之外，HRP-3是否还存在细胞核内发挥促增殖调节作用，还有待于进一步研究。此外，本文还进行了另一项小的研究工作，即从人脑cDNA文库克隆了一个新的含CRAL-TRIO结构域的成员，细胞内视黄醛结合蛋白类似蛋白(Cellular retinaldehyde binding protein-like，CRALBPL)基因。它定位在染色体8q12.2，包含1694个碱基，开放阅读框编码354个氨基酸，CRAL-TRIO结构域位于118-279位氨基酸。在人18种组织cDNA的RT-PCR分析显示CRALBPL主要在脑中表达。CRAL-TRIO结构域的比对分析显示CRALBPL与CRALBP有45％的相似性。通过Western分析表明CRALBPL的分子量约为40kD，EGFP-CRALBPL融合蛋白在转染的Hela细胞中定位于细胞质。由于CRALBP是在脊椎动物的视觉过程中作为一个下游的蛋白发挥作用，它作为内源性配体携带11-顺式视黄醇和11-顺式视黄醛，可能是视觉周期的一个功能组分。CRALBPL作为CRALBP的同源基因，其克隆和鉴定为视觉生理研究提供了一种新的候选分子材料。

全文目录

目录  3-5
缩略词表  5-6
中文摘要  6-8
Abstract  8-11
第一章 HRP-3在肝癌组织中上调表达的生物学意义探讨  11-65
  前言  12-14
  材料和方法  14-34
    一材料与试剂  14-20
    二主要仪器设备  20-21
    三生物学信息途径和计算机分析软件包  21
    四技术路线和实验方法  21-34
  结果  34-52
    一 HRP-3在肝癌组织和肝癌细胞中显著上调表达  34-41
    二 HRP-3具有可分泌蛋白和核定位蛋白的双重特性  41-43
    三 HRP-3重组蛋白具有促生长因子活性  43-45
    四 HRP-3能够激活MAPK信号通路  45-47
    五稳定表达的外源HRP-3的细胞株生长速率增加并显示较强的MAPK信号  47-52
  讨论  52-57
  参考文献  57-65
第二章人类CRALBPL基因的克隆和特征的初步研究  65-82
  前言  66-67
  材料和方法  67-71
    一材料和试剂  67-68
    二主要的仪器设备  68
    三生物学信息途径和计算机分析软件包  68
    四技术路线和实验方法  68-71
  结果  71-78
    一 CRALBPL基因的克隆和特征分析  71-74
    二 CRALBPL的蛋白特征和结构域的同源性分析  74-75
    三 CRALBPL基因的组织表达谱分析和亚细胞定位  75-76
    四 CRALBPL的重组表达  76-78
  讨论  78-79
  参考文献  79-82
小结  82-83
综述肝癌细胞衍生生长因子(HDGF)家族研究进展  83-101
  参考文献  96-101
博士期间发表的论文和参与的编著  101-102
致谢  102-103

HRP-3在肝癌组织中上调表达的生物学意义探讨

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